Способ получения инсулина

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

{11) б2б779

СЕЮЗ СОВЕтСКНК

Социапистическни

Ржпублик (Я) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 1204,77(21) 2472949/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 0510,т8. Бюллетень № 37 (45) Дата опубликования описания140878 (53) М. Кл.

А 61 К 37/26

Государствеиный комитет

Совета Министров СССР ио делам изобретений и открытий (53) УДК 615.45:

:615.361., .37 (088. 8) (72) Авторы H.A.Äoíåöêèé, P. И. Каратеева, H Ã.Нестерова, П. М. Кочергин, ИЗОбрЕтЕНИя Б.Г.Горшков, М.Ф.Архипова, Л.В.Васильева и В.М.Денисова (. аявнтель

Всесоюзный научно-исследовательский институт технологии

73) Заявитель кровезаменителей и гормональных препаратов (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности в частности к получению медицинских препаратов, применяемых в медицинской практике при лечении сахарного диабета.

Известен способ получения инсулина путе . экстрации поджелудочной железы подкисленным водным эталоном, осаждением белковых примесей,. вакуумдистилляцией экстрактов двоййым высаливанием инсулина хлористым натрием,отделением белковых примесей при повышении рН раствора до 7,0, изоэлектрическим осаждением и перекристаллизацией целевого. продукта из цитратного буфера °

Выход кристаллического инсулина—

2700 ел/кг, активность — 24 ед/мг1Ц .

Однако известный способ не обеспе- . чивает высокой частоты и выхода кристаллического инсулина.

Цель изобретения — повышение чистоты и выхода кристаллического инсулина. 25

Эта цель достигается тем, что оса дение белковых примесей проводят пос- ле первого высаливания хлористым натрием из раствора инсулина-сырца при рН = 2,8-3,2 и температуре 3-5 С, аморфный инсулин осаждают при концентрации ацетата цинка 0,35-0,5 М на грамм инсулина при рН = 5,2-5,4.

Пример 1. 1 кг измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота экстрагируют 3,5 л 82 — ного о этилового спирта при рН = 2,8-3,2 и температуре 16 С в течение 3 часов.

3кстракт отделяют центрифугированием, а остаток повторно экстрагируют.1,1л

65О- ного этилового спирта при рН=

2,8-3,2 в течение двух часов. В экстракте 203-ным растворомКаОН устанавливают рН = 3,5 и к нему добавляют 20%ный водный paczaopCOCEZ(15 мл на 1 л экстракта) .Через 10-15 минут устанавливают рН = 4,3-4,5 и после сепарирования экстракта упаривают на вакуум в выпарной установке при рН = 3,5. Водный раствор обезжиривают и высаливают инсулин 28%-ным водным растворомКэСР.

Получают 1 г инсулина-сырца.

lг инсулина-сырца растворяют в

100 мл дистиллированной воды, корректируют рН раствора до 3,05, и раствор выдерживают при температуре+5 С в г течение 12 часов, Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера с добавлением в раствор 10 г кизельгура. В полученном фильтрате устанавливают рН=5,3 и к нему добавляют 3 мл

26779

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Техред Е. Давидович Корректор И. Гоксич

Редактор Ж.Рожкова

5513/9 Тираж 703 Подписное

ПНИИПИ Государственного комитета Сонета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Раушская наб. д. 4/5

Заказ

А L А Ь

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 б

10<, †íî раствора ацетата цинка. Раствор выдерживают при температуре 5 С в течение 24 часов, выпавший осадок ,отделяют центрифугированием, растворяют в 40 мл дистиллированной воды, содержащей 520 мг лимонной кислоты.

Затем в раствор добавляют 7,2 мл ацетона, 0„72 мл 5%-ного раствора ацета та цинка и 0,024 мл фенола. Раствор охлаждают до+1 С,корректируют рН

12,5Ъ-ным аммиаком до pH 8,0-8,5„

При перемешивании раствора через 3 м нуты корректируют рН до 6 р 0-6, 2,, и раствор при температуре+ и выдерживают в тсчение 2-х часов и затем при комнатной температуре в течение 24 часов.

Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, а затем высушивают и вакууме при 20 С до постоянного веса. Выход инсулина — 3220 ЕД/кг поджелудочной железы, активность -25,5 ЕД/мг.

Пример 2. Зкстракцию и обработку экстрак "à до стадии получения инсулина-сырца после первого высаливания производят, как описано в примере 1.

l г инсулина-сырца растворяют в

100 мл дистиллированной воды, выдер" живают при комнатной температуре и перемешивании в течение 2-х часов и затем 10 часов при температуре+ЗОС.

Выпавший осадок отфильтровывают, а в фильтрате при перемешивании устанавливают рН=5,0, добавляют к раствору

1,5 мл 10%-ного раствора ацетата цин,ка, и раствор выдерживают в течение

24 чабов. Выпавший осадок аморфного инсулина отделяют центрифугированием, растворяют в 50 мл дистиллированной воды, содержащей 650 мг лимонной кислоты, в раствор добавляют 9 мл ацетона, 0,9 мл 5%-ного раствора ацетата, цинка и 0,03 мл фенола.

Раствор охлаждают до температуры

+1 — 3 С, устанавливают 12,5%-ным

0 аммиаком pH = 8,0-8,5 и через три минуты при перемешивании понижают

10%-ной соляной кислотой до pH=6,2 через ?О часов до рН 5,8. Раствор выдерживают при этой температуре, и выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и высушивают в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса.

Выход инсулина — 3000 ЕД/кг поджелудочной железы, активность -24,5Ед/мг.

Предлагаемый способ получения инсулина позволяет по сравнению с известным упростить стадию химической очистки инсулина, полученного после первого высаливания (до 2-х операций) 0 более качественно и без потерь инсулина отделить белковые примеси из раствора, количественно выделить инсулин при изоэлектрическом осаждении и кристаллизации, сократить технолоl5 гический процесс на 120 часов (в расчете на 1 миллион единиц инсули на), повысить выход инсулина с 2700 до 3200 ЕД/кг поджелудочной желе.-ы, а также его чистоту (снижение интенЯО сивности полос белковых примесей на

j электрофореграммах злектрофореза в полиакриламидном геле .

Способ получения инсулина путем экстракции поджелудочной железы подкисленным водным этанолом осаждением т белковых примесей, вакуумдистилляцией экстрактов, двойным высаливанием инсулина хлористым натрием, отделением белковых примесей при повышении рН раствора до 7,0 изоэлектрическим осажУ дением аморфного инсулина и перекристаллиэацией целевого продукта из цит85 ратного буфера, о т л и ч а ю щ и й-. с я тем, что, с целью повышения чис- тоты и выхода кристаллического инсулина, осаждение белковых примесей про-: водят после первого высаливания, хло40 ристым натрием из раствора инсулина. сырца при рН = 2,8-3,2 и температуре

3-5ОС, аморфный инсулин осаждают при концентрации ацетата цинка 0,35-0,5М на грамм инсулина при рН= 5,2-5,4.

Источники информации, принятые вс внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР

9 332832, кл. A 61 К 17/00, 1972.