Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси

 

О h И С A Н И Е ()888909

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советскик

Социалистических республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 05.06.80 (21) 2936309/30-15 с присоединениеат заявки Рй— (23) Приоритет— (5l)M. Кл.

А 23 J 1/18

Гасударственный камитет

СССР по делам кзебретениЯ и аткрыткЯ

Опубликовано "5 ° 12 81- Бюллетень М 46

Дата опубликования описания 15. 12.81 (53) УДК 547. 965 (088. 8) С.М.Андреев, О.М.Галкин, В.В.Николаева, — .

А.М.Мамцис, E.Ñ.Âàéíåðìàí и С.В.Рогожин (72) Авторы изобретения ь ;> i Q

". М Н

Ордена Ленина институт элементоорганических соединений АН СССР

1 (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ ИЗ ИХ СМЕСИ

Изобретение относится к прикладной биохимии и микробиологии и касается разделения белков и нуклеиновых кислот, содержащихся к экстрактах, получаемых из объектов природного проис- хождения, в частности из растений, микроорганизмов, тканей животных, и может быть использовано как в лабора" торной практике, так и при решении ряда практических задач, связанных с получением очищенных белков и нуклеиновых кислот.

Известен способ разделения белков и нуклеиновых кислот, основанный на различии в распределении биополимеров и двухфазных системах. Согласно это15 му способу к 25-803-ному водно-спиртовому раствору белково-нуклеиновой смеси добавляют 1-84 ыеорганической водорастворимой соли по отношению к

20 исходной смеси. При этом образуется двухфазная система, состоящая из водно-спиртовой фазы, в которой концен-, трируются белки, и водно-солевой фазы, которая содержит нуклеиновые кислоты. Этот метод позволяет получать белок с низким содержанием нуклеиновых кислот (1,8-2i) без потери функциональных свойств 1 11.

К недостаткам этого метода следует отнести сложность аппаратурного оформления процесса, особенно в условиях крупнотоннажного производства.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси путем обработки их раствора ангидридом дикарбоновой кислоты при рН 7,5 с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке. По указанному способу обработка исходной белковонуклеиновой смеси осуществляется ангидридом дикарбоновой кислоты, в частности янтарным ангидридом, при весовом соотношении исходная смесьангидрид 1:1 - 1:0,4. Этот способ позволяет получать белок с высоким

88890

68,8

65,5.

62,2

60,5

53,5

0,22

9,00

8,00

7т00

6,00

5,00

4,00

3 выходом (904), низким содержанием нуклеиновых кислот и хорошими фуннциональными свойствами (2 j..

Недостатки этого способа заключаются в большом расходе янтарного ангидрида и недостаточно высоких фун-: кциональных свойствах получаемого белка.

Целью изобретения является улуч. шение функциональных свойств белка, 1о полученного разделением белково нуклеиновой смеси.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве ангидрида дикарбоновой кислоты используют ангидрид Яацетилглутаминовой кислоты при весовом соотношении белок — ангидрид Nацетилглутаминовой кислоты от 1:0,4, до 1:0,6.

Пример 1. 0,5 r белково"нуклеиновой смеси, содержащей 0,4 г белбелка, растворяют в 25 мл 0,1 н раствора едкого натра; К полученному раствору при рН 7,5 прибавляют при перемешивании порциями 0,16 г ангид рида N-ацетилглутаминовой кислоты, выдерживают l ч при рН 7,5 и осаждают белок в изоэлектрической точке добавлением 2 н НС1. Белок отделяют центрифугированием, промывают водой .и сушат. Из супернатанта при рН 1,0

30 осаждают нуклеиновые кислоты добавлением 2 н НС1, отделяют центрифугированием, промывают пропанолом, серным эфиром и сушат на воздухе.

Получают 0,35 г (87,5i) белка с содержанием общего азота 15,03, нуклеиновых кислот 2,08 и 0,09 r нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 903. Растворимость полученного белка составляет, мг/мл: при рН

9 точке, добавляя 2 н НС1 . Белок o iделяют центрифугированием, промывают водой и сушат.Иэ супернатанта добавлением 2 н НС1 при рН 1,0 осаждают нуклеиновые кислоты, промывают пропанолом, серным эфиром и сушат. Получают 70 г (933) белка с содержанием общего азота 14,9i, нуклеиновых кислот 1,84 и 10 r нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 92 . Растворимость полученного белка составляет, мг/мл: при рН 9,00 70,2

8,00 68,3

7,00 65,5

6,00 62,1

5,00 55,0

4,00 0,23

Определение функциональных свойств белков (растворимость в интервале рН 4-11, емульгирующая способность), полученных разделением белково-нуклеиновых смесей, осуществляется следующим образом.методика определения растворимости белков.

1 г белка суспендируют в 50 мл дистиллированной воды, добавляют при перемешивании 5 н раствор едкого натра до рН 12 0, выдерживают 0,5 ч при перемешивании. Затем добавлением

0,2 н раствора соляной кислоты доводят рН раствора до 11,0 и отбирают аликвоту ° Аналогично отбирают аликвоты при рН 9,0; 7,0; 6,0; 5,0; 4,5;

4,0; 3,5; 3,0 °

Отобранные аликвоты центрифугируют при 15000 об/мин в течение 40 мин при 25 С. Концентрацию белка в супернантах определяют по биуретовой реакции спектрофотометрически на приборе

"Speco1" при длине волны 540 нм.

Полученные результаты растворимости белков в зависимости от рН раствора приведены в таблице.

Белок, мг/мл, полученный по способу

3 0

0,15

0,18

3,5

0,10

4,0

0,22

0,20

28, 00

1,00 п р и м е р 2. 100 г белковонуклеинового концентрата, полученно- So го иэ биомассы дрожжей р. Candida

Mucoderma и содержащего 75 г белка, растворяют в 1,5 л 0,1 н раствора едкого натра. К полученному рас.твору прибавляют при рН 7,5 порциями ы

45 r ангидрида N-ацетилглутаминовой кислоты, выдерживают 1 ч при рН 7„5 и осаждают белок в изоэлектрической предлагаемому известному

888909 В бу, составляет 53,73, а полученных по известному способу - 38,Я.

Таким образом, предложенный способ выделения белков и нуклеиновых

3 кислот из белково-нуклеиновой смеси позволяет получать белок с низким содержанием нуклеиновых кислот 1 82,04 и хорошими функциональными свойствами и, в частности с высокой растворимостью в физиологическом интервале рН (5-9), что особенно важно для их последующего йспользования. Растворимость белков, полученных по предложенному способу выше, .13 чем у белков, полученных llo известному способу. Кроме того, предложенный способ дает возможность снизить расход ангидрида при обработке бел-. ково-нуклеиновой смеси.

Продолжение тал

Белок, мг/мл, полученный по способу рН и редла гаемому1 известному

3,20

53,50

5,0

3»30

60,50

6,0

3,40

62,20

7,0

9,00 67,42

3,45

70,65

3,60

11,0

Формула изобретения

Составитель В.Захаров

Редактор Т.Веселова Техред 3. Фанта Ко ектор Л. Бокшан рр

Заказ 10795/5 Тираж 567 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. /5.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Методика определения эмульгирующей способности белков.

100 r белка помещают в 50 мл 20 яйцевидную колбу, добавляют 10 мл дистиллированной воды и перемешивают при рН 7,0"7,5 до получения раствора или однородной суспензии..

Затем добавляют 10 мл рафинирован- Ы3 ного подсолнечного масла и перемешивают в течение 1 мин при 16000 об/мин.

Полученную эмульсию помещают в 10 мл центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 1300 об/мин. 30

Эмульгирующую способность белков рассчитывают по формуле

В-2А

Э. С. = — 1 004

В

3S где Э.С. - эмульгирующая способность белка, 3

А — высота водного слоя в пробирке, мм

В - полная высота эмульгируе- щв мой смеси в пробирке,мм .

Эмульгирующая способность белков, полученных по предлагаемому спосоСпособ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси путем обработки их раствора ангидридом дикарбоновой кислоты при рН 7,5 с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью улучшения функциональных свойств получаемого белка, в качестве ангидрида дикарбоновой кислоты используют ангидрид Х-ацетилглутаминовой кислоты при весовом соотношении белок - ангидрид N-ацетилглутаминовой кислоты от 1:0,4 до 1:0,6.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

N 557785, кл. A 23 J 1/18, 1977.

2. Патент ClllA N 4168262, кл. 260-112 R, 1979.