Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов

 

Союз Советсиих

Социалистических

Ресттубпии

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

I ./ .г б

°,- (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 21.01.80 (21) 2873327/30-15 (5()М. Кл.

С 01 N 33/48

С 01 N 33/52 с прнсоелинением заявки Рй ЪВ дяРстааккъЮ камитат

СССР йв делам изобретений и открытий (23) П риоритет

Опубликовано 23.02.82. Бюллетень М 7

Дата опубликования описания 25.02.82 (53) УДК 543: 547.

915(088.8) (72) Авторы изобретения

Б. А. Ломсадзе, Ю. А. Владимиров, N. А. Царцидзе, О. С. Джишкариани и М. П. Мардалейшвили

Тбилисский ордена Трудового Красного Знамени

1 государственный университет (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО КОЛИЧЕСТВА

ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ фОСФОЛИПИДОВ

Изобретение относится к биохимии и химии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипи- дов в крови, в органах животных, например, печени, а также в опухоли.

Известен способ определения коли5 чества фосфолипидов, включающих выделение фосфолипидов из крови, растворение их, добавлсние к раствору фосфолипидов водного раствора красителя

10 оранжевого кислотного, смесь разделяют отстаиванием в делительной воронке и определение количества фосфолипидов по количеству перешедшего в органическую фазу красителя (1 1.

Недостатками этого способа являют, ся большая трудоемкость. Раствор красителя вносят в мицеллу в несколько приемов, а смесь отделяют отстаиванием после внесения каждой пробы и продолжительность процесса определения (30-60 мин), а также невозможность определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов.

Цель изобретения - разработка способа определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов и повышение точности определения.

Поставлен lая цель достигается тем, что для растворения фосфолипидов используют четыреххлористый углерод, а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридинового оранжевого 3,2-10 -6.10 тМ концентрации, причем степень распределения красителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивности поглощения красителя в водной и органической фазе.

Пример. Липиды экстрагировали 20-ти кратным объемом смеси хлороформметанопа 2:1, два раза смесью (,1:1} и затем осадок заливали этой же смесью (1:1! и оставляли на ночь.

На следующий день экстракция пипилоя

90 проводилась еще дважды смесью хлороформметанола (2:1) .

Объединенные липидные экстракты отмывали от водорастворимых примесей охлажденным раствором 0,3 Н NaC1 добавляемым с таким расчетом, чтобы верхний водный слой содержал не 6олее 503 спирта (дабы он не извлекал фосфолипиды).

После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывался.

Пленка, образующаяся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенный и водно-спиртовый) растворялась добавлением небольшого количества этилового спирта, Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды упаривали под вакуумом досуха при комнатной температуре. Общее количество липидов определяли весовым методом, сухой остаток растворяли в органическом растворителе — четыреххлористом углероде — СС1, из расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось

2 мг липида.

Процесс выделения липидов и определения их в них суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов проводили при стандартных условиях (комнатная температура — 1820 С, давление - 760 мм рт. ст..) о

К фосфолипидам, растворенным в

СС1 добавляют водный раствор акридинового оранжевого, разделяют органическую и водную фазы отстаиванием в делительной воронке и измеряют интенсивность поглощения красителя в органической и в водной фазах. Вычисляют коэффициент распределения красителя между двумя фазами и опредеПолученное количество фосфатидилинозита, мкг

Ошибка опыта, Наименование способа

114

1 7

Таблица2

Ошибка опыта, 1

Полученное количество фосфатидилинозита, мкг

3,2-10

4 10

3,4

1,7

4,2

116

118

11

6 -10

Тонкослойная хроматография

Способ определения отрицательно заряженных фосфолипидов

Концентрация акридинового оранжевого, моль

74 4 4 ляют количество отрицательно заряженных фосфолипидов по стандартной кривой. Стандартная кривая строится по известным концентрациям фосфолипидов. Коэффициент распределения красителя между двумя фазами определяют по формуле

Ц

10 н а

I (4n) где ВСС вЂ” оптическая плотность краф сителя в органической

15 фазе;

- оптическая плотность кра« сителя в водной фазе; ф Л) - концентрация фосфолипидов.

Продолжительность процесса определения 5-10 мин при 18-20 С.

Сравнительные данные определения заданного (например, 12i3 мкг) количества отрицательного заряженного фосфатидилинозита с помощью предла25 гаемого и известного способами приведены в табл. 1.

Данные осуществления способа определения заданного (например, 120мкг,) количества отрицательно заряженного фосфатидилинозита при граничных и среднем значениях концентраций водного раствора красителя приведены в табл. 2.

Использование предлагаемого способа определения отрицательно заряженных фосфолипидов обеспечивает быстроту и простоту определения, а также более высокую точность анализа в сравнении с известными способами.

Т а б л и ц а 1

907434

Формула изобретения.Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов, включающий выделение фосфолипидов из крови, растворение их, добавление водного раствора красителя, разделение органической и водной фаз в делительной воронке и определение количества отрицательно заряженных фосфолипидов по степени распределения красителя между двумя фазами, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, для растворения фосфолипидов используют тыреххлористый углерод, а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридинового оранжевого 3,2 ° 10 "- 6 ° 10 M концентрации, причем степень распределения красителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивности поглощения красителя в водной и органической фазе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР и 412548, кл. С О1 И 33/02, 06.03.72.

Составитель Л. Рубинова

Рецактор А» Шандор Техреду E. Харитончик Корректор м.

Заказ 581/52 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР пр делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-)5, Раушская наб. g. 4/ филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4