8-(6-аминогексил)-цикло-амф-силохром в качестве сорбента для биоспецифической очистки цикло-амф-связывающих белков

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 160680 (21) 2941023/23-04 (51) М. КЛ.

Союз Советских

Социалистических

Республик

С 07 F 7/18

С 07 F 9/09

С 07 Н 19/00 с присоединением заявки (Чо

{23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 230882. Бюллетень Мо 31

153) УДК 547. 245 (088. 8) Дата опубликования описания 230882 и

Ф

Ф.Ф.Шаги-Мухаметова, K.M. Куриненко и Д.О. Стерлигов (72) Авторы изобретения

) Казанский ордена Ленина и ордена Трудовфго Красного

Знамени государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина (71) Заявитель (54) 8-(б-АМИНОГЕКСИЛ)-ЦИКЛО-АМФ вЂ” СИЛОХРОМ В КАЧЕСТВЕ

С0Р5ЕНТА ДЛЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОИ ОЧИСТКИ ЦИКЛΠ†АМФСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

Изобретение относится к химии кремнийорганических соединений, а именно к новому 8-(б-аминогексил)—

-цикло-АМФ-силохрому формулы,Н 5

НбС20 ОС Н 7 г =

Схе °:Si — (СН2)з Э1Н(СН ) ХН(СН2) 1ЧН 1 (ОС2Н5

О О 1Р

0=P.

ОН который может быть использован в качестве сорбента для биоспецифической очистки цикло-АМФ вЂ связывающ белков.

Известно использование 8-(б-амино15 гексил)-цикло-АМФ-сефарозы в качестве сорбента для биоспецифической очстк и ци нк о — АМФ- св язывающих белков(1). этот сорбент характеризуется пло- 2р хими гидродинамическими свойствами, так как на проведение одного цикла хроматографии требуется 12-24 ч, кроме этого он не устойчив по отношению к микроорганизмам. 8-(б-АМННогексил) -цикло-АМФ-силохром формулы (1) является новым и в литературе не описан.

Целью изобретения является расширение ассортимента сорбентов для биоспецифической очистки цикло-АМФсвязывающих белков и повышение их стабильности.

Поставленная цель достигается новым 8-(6-аминогексил)-цикло-АМФ-силохромом формулы (1), который обладает более высокой стабильностью по сравнению с известным сорбентом для биоспецифической очистки цикло-АМФ-связывающих белков .

Соединение формулы (1) получают взаимодействием аминосиланизированного силохрома, активированного глутаровым альдегидом, с 8-(б-аминогексил)-амино-цикло-АМФ с последующим восстановлением образующегося продукта сухим боргидридом натрия.

Пример 1. 2 r аминосиланизированного силохрома, содержащего

80,и. моль/г аминогрупп активируют добавлением 5 мл 25% глутаральдегида в 15 мл 0,1 М фосфатного буфера

РН 6,9 и выдерживанием смеси при комнатной температуре при перемешивании в течение 12-16 ч;

В результате активации получают вещество формулы

C,Í,0 ОС Н, r

Сх . 81- (СНх) М= СН-(СНа) — СНО 11

ОС Н

952849

ВНИИПИ .Заказ 6201/37 Тираж 388 Подписное

Филиал,.ППП "Патент", г.ужгород,ул.Проектная,4

К активированному силанизированному силохрому, отмытому 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,9) от избытка глутарового альдегида, приливают раствор 8-(б-аминогексил) -аминоцикло-АМФ (200 Мг в 10 мл 0,1 М боратного буфера, рН 10,1) . Смесь оставляют при перемешивании на 12 ч по т истечении указанного времени проводят восстановление сухим боргидридом натрия и отмывают 0,5 М раствором

СН СООИа (рН 4,5) .

Пример 2. Изучение взаимодействия биоспецифического сорбента с цикло-АМФ-зависимым белком.

Для проверки взаимодействия с цикло-АМФ-зависимым белком к 0,5 г полученного сорбента приливают 1 мл раствора белка в концентрации от 1 до 10 опт.ед. (1-10 мг/мл по A< m) .

В качестве препарата использовали фракцию после очистхи на гидроксилапатите при выделении протеинкиназы на мозге свиньи.

B зависимости от исходной концентрации исследуемого белка с описанным сорбентом взаимодействует до 92-95% белка соответственно.

Сорбционная емкость, установленная по взаимодействию с цикло-АМФ-зависимым белком, составляет 7080 опт.ед. (по А „птп) белка .на 1 г сорбента.

Специфичность взаимодействия с данным сорбентом подтверждается возможностью биоспецифической элюции 10-30 мМ раствором цикло-АМФ, что в свою очередь выявляется наличием и элюатах цикло-АМФ связывающей активности после обессоливания на сефадексе G-50) .

Принадлежность силохрома к неорганическим носителям определяет высокую устойчивость аффинных сорбентов.

Препараты, полученные на основе силохрома, отличаются также хорошей фильтруемостью, нысокой механической прочностью, которая .позволяет использовать их для выделения цикло-АМФ-зависимых белков в препаративных масштабах.

Прочность связывания цикло-АМФ-связывающего белка с сорбентом черезвычайно велика, Элюция 1 M растнором NaCI не эффективна. Элюция возможна либо растнором цикло-АМФ, либо б М раствором моченины, Содержание иммобилизированного аналога цикло-AMC составляет

25, .моль нуклеотида/г сорбента и остается неизменным (24-25рлмоль) как в процессе многочисленных хроматографических циклов — до 30, так и при хранении н растворе при

+4 в течение года или лиофильно высушенном состоянии. Это превышает содержание нуклеотида н известных сорбентах в 6-7 раз. ИК-спектры иммобилизированного аналога цикло5 -АМФ после 25-30 хроматографических циклов идентичны исходному препарату. Все это в отличие от известного является свидетельством высокой стабильности предлагаемого аффинного !

0 сорбента.

Установлена скорость отщепления аналогов цикло-АМФ, иммобилизованных на CNBr-сефарозе: при рН 5,0-0,5 нмуч и при рН 8,0-2,2 нм/ч для концент15 рации иммобилизованного лиганда

1200 нм/г сорбента, эти скорости со-ответствуют отщеплению 0,04-0,2% в час от исходного содержания лиганда.

Аффинные сорбенты на основе сефарозы характеризуются плохими гидродинамическими свойствами на проведение одного цикла хроматографии требуется 12-24 ч. Исходя из этого, . полное отщепление аналога цикло-АМФ, иммобилизованного при помощи СИВг, произойдет через 100-200 циклов при рН 5,0 или 20-40 циклов при рН 8,0.

Кроме того, аминосилохром формулы (1) принадлежит к органокремнеземам и характеризуется механической прочностью, хорошими гидродинамическими свойствами — длительность хроматографического цикла на этом сор бенте не лимитируется скоростью про35

Кроме того, аминосилохром устойчив к воздействию микроорганизмов, что позволяет хранить данный аффинный сорбент как в высушенном. состоянии, так и в растворе, и допускает много40,кратность использования для хроматографии.

Формула изобретения

8-(б-Аминогексил) -цикло-АМФ-сйлохром формулы

4S

С Н О 0CgHg

see< . N 1(Ъ.. ° с -(сн,(-ян(сн,(;юн(сн,) - (>

2 5

50 0 о=р,, OH в качестве сорбента для биоспецифической очистки цикло-АМФ-связывающих белков.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Tesser G. и .др. Limitations

of affinity chromatography. Seph—

parose-found cycIic 3,5-adenosine

monophosphate. FEBS Lett., 1972, Z3 1, р. 56-58.