Способ определения гомосерина
ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Ия К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советскик Социалистическии Республик (61) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено05.01.81 (2! ) 3229151/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет Опубликовано 23,08.82. Бюллетень № 31 Дата опубликования описания 23.08.82 (51) М. Кл. G 01 N 31/08 9кударстианный комитет СССР до делам иэооретеиий и открытий (5Ç) УДК543.54.. 45 (088. 8 ) (72) Авторы изобретения А. М. Босенко, Л. П. Шипяева, Н. Н, Яким A. В. Кузнецова, Е. И. Вапьгер и С. Ю. Юиэов..;-";.> :-..." Белорусский ордена Трудового Красного Ъ1амени " 1 технологический институт им. С. М. Кирова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЭМОСЕРИНА Изобретение относится к анапитической химии, а именно к способам опредепения гомосерина. Известен способ определения гомосерина методом тонкоспойной хроматогра5 фии на сипуфоповых ппастинках, основанный на различной степени средства аминокиспот к неподвижному носителю (11. Недостатком способа является малая точность и дпитепьность анализа (3-6 ч).10 Наиболее бпизким по технической сушности и достигаемым резупьтатам явпяется способ количественного определения аминокиспот, в том чиспе гомосерина газожидкостной хроматографией (ГЖХ) петучих К -трифторацетипметиповых эфиров аминокислот, получаемых реакцией ацетипирования аминокиспот триэтанопамином и метиптрифторацетатом в метаноле I 2J Недостатком способа является мапая 2о точность и дпитепьность анапиэа (4-5 ч). Бель изобретения — повышение точности определения и сокрашение времени про ведения анализа. Поставленная цепь достигается тем, что, согласно способу определения гомосерина, вкпючаюшему гаэожидкостную хроматографию летучих производных гомосерина, анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-30 С и в случае определения сино тетического гомосерина допопнитепьно обрабатывают диазометаном с поспедуюшей газожидкостной хроматографией образуюшихся летучих производных. В качестве летучих производных используют N, 0-трифторацетиппроизводное гомосерина (при опредепении гомосерина в биологических объектах) ипи метиловый эфир 1 1,0-трифторацетипгомосерина (при определении гомосерина в синтетических продуктах). При определении гомосерина в биологических объектах N,О-трифторацетиппроизводные гомосерина попучают реакцией ацетипирования гомосерина трифторуксусным ангидридом при концентрации 50дорН 7, о У по 4 1а 400 Ю 1 где C3 95356 100 мас.% в среде ацетона и температуре 15-30ОС в течение 3-5 мин. При опредепении гомосерина в синтетическом продукте М,О-трифторацетиппроиэводное гомосерина попучают реакцией аце-5 типирования трифторуксусным ангидридом при концентрации 10-25 мас.% в среде ацетона при 15-30 С в ечение 3-5 мин. о Метиповый эфир Я,О-трифторацетипгомосерина получают метилированием диазоме- 0 0 таном в эфире в течение 0,5-2 мин, В качестве внутреннего стандарта при.меняют высшие спирты и эфиры моно-,и дикарбоновых органических киспот. Гаэохроматографический анализ прово- 15 дят на пюбом типе хроматографа с ппа« менно-ионизационным детектором. Хроматографическая копонка из нержавеющей стапи (50-300 см длиной и внутренним диаметром 0,2-0,4 см) запопне- 2о на 0,5-6,0%-ной полиэфирной жидкой фазой на инертном носитепе, например по пиэтиленгпикольадипинат на хроматоне И -ЛЖ - НМ9 5 Газ-носитепь — любой инертный газ, например азот. 25 При опредепении гомосерина в продукте, полученном химическим методом, используют режим с линейным программированием при изменении температуры от 50 до 200 С (1-10 С/мин) или изотер-зо о Ъ мический при 120 С. При опредепении гомосерина в биологических продуктах испопьзуют режим с линейным программированием при изменении температуры от 20 до 200 С {1- „ о 10 С/мин) или изотермический при 160 С. Относительная ошибка определения 2-4%. При опредепении гомосерина в биологических и синтетических продуктах, сойержащих эначитепьные количества примесей,40 в частности нейтральные кислоты и неорганические киспочы, необходимо очищать . гомосерин с помощью катионообменной смолы, например КУ-2-8 в Н -форме, элюируя гомосерин 4 н. раствором аммиака. Смола переводится в Н+-форму одним нз обычных способов. Пример l, Определение гомосеоина в модельных растворах, содержащих химически чистый гомосерин, в синтетиS0 ческом гомосерине, попученном химическим, методом. Копичественный анапиэ опредепения гомосерина проводят по высоте пиков на хроматограмме методом калибровки по описанной ниже методике. )1пя учета воэ55 можных механических потерь гомосерина при очистке проб с помощью ионообменных смол капибровочный график строят ! с испопьэованием раствора химически чистой аминокислоты, которая выдепяется также ионообменными смолами в идентичных условиях. 5,0000 r синтетического гомосерина взвешивают на аналитических весах с точностью до четвертого знака, растворяют дистиллированной водой в мерной копбе на 25 мп, 3 r подготовленного катионита влажностью 50% запивают 1 мп пробы, добавляют 5 Мп дистиллированной воды дпя лучшего перемешивания и проводят сорбцию аминокислоты в течение 15 мин при интенсивном перемешивании содержимого с помощью магнитной мешалки. Смопу, содержащую аминокислоты, промывают во . взвешенном слое дистиппированной водой Катионит отделяют от жидкости на фипьтре Шотта,.при этом хорошо отсасывают межчастичную воду. Содержание воды в смоле 50%, что составляет 1,5 мл. Смолу количественно переносят в стакан, добавляют 2,5 мп 4 н. ЯНСООН и проводят эпюирование гомосерина в течение 15 мин. После оседания смолы надосадочный раствор объемом 1 мп вносят в колбу с притертой йробкой дпя упарива« ния. К остатку добавпяют 0,5 мп 10%-ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне. Реакцию ацетилирования проводят в течение 5 мин при 15 С. Остаток реагентов удапяют хоподным воздухом в течение 5 мин. К остатку добавляют 1 мл диазометана, встряхивают в течение 0,5 мин, удапяют диазометан холодным .воздухом, добавляют 1 мл 0,2%-ного раствора додеканового спирта в ацетоне (внутренний стандарт). Пробу вводят в испаритепь хроматографа. Общее время анапиза 4560 мин. Время газохроматографического анализа 15-20 мин. Расчет процентного содержания гомосерина в анапизируемом образе ведут по формуле процентное содержанйе гомосе-: рина в анализируемом образце; содержание гомосерина по калибровочному графику, мг/мл; навеска синтетического гомосерина, мг; 4 - содержание аммиака и воды в смоле, мл; 25 - общий объем поспе разведения; 100"проценты, 953561 Пример расчета: С 3,97 ° 4 ° 25 Табнииа 1 Время ре вкнии вие1 тиlIilpoBs ния, мин К ониентI рвния Лй Образны растворов пп, гомосерлнв 1 ТФЛ в ! анетоие 1 мвс.Ъ 1, Л1оаельный водный раствор, содержаший 1,5Ъ химичес кн чистого гомосерпна 1,4 1,5 1,52 3 15 4 22,5 3О 3 15 4 22 5 1О 1,5 1,47 17 5 1,5 э,э 1 ° 45 \5 во 7,95 7,9В 7,97 Раствор, соаержашнй голд» серии, полученный химическим методом ео ео эо 9,45 3. Образен (по и. 2) с добавкой 1,5Ъ химического гомосерк ив 9,27 1,9 во 9,4В 9,31 22,5 17,5 ео 2,4 9,47 9,2В 25 эо 710 240-300 4. Изаестныя П р и м е ч а н н е. Ошибка определения предлагаемого метода не превышает t 3,ЭЪ. абпипа 2 1, Искательный водный раствор, содержащий 5 г/л химически чистогр гомосерина 40 б 2,4 5 1,8 5 1 50 3 4,92 22,5 5,05 2, Гомосерииовая купьтуральиая жидкость, полученная с помошью микроорганизмов 15 4,0 22,5 3,98 4,03 100 9 1,6 8,98 3,1 9,03 2,7 3, Образец (по п, 2) с добавкой 5 r химически чистого гомосерина на 1 и образца 8,85 8,70 8,78 22,5 75 100 ЭО 100; С = 7,95%. Примеры 2, 3 и резупьтаты определения гомосерина в модепьных растворах, синтетическом гомосерине, полученном химическим методом, приведены в табл.1. Пример 4. Опредепение гомосерина в модельных растворах, содержаших химически чистый гомосерин в биопогичес- ких объектах. Методика выдепения гомосерина из биологических объектов аналогична описанной в примере 1. 1 мп аммиачного раствора гомосери15 на вносят в колбочку с притертой пробкой дпя упаривания. К сухому остатку добавляют 0,4 мл 50%ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне, Реакцию ацетипирования проводят в течение 3 мин при 15 С. Остаток реагентов удаляют хоподным воздухом в течение 0,5-. 1 мин, К остатку добавпяют 1 мп 0,1%ного раствора дибутипфтапата в ацетоне (внутренний стандарт). Расчет ведут аналогично примеру 1.. Примеры и результаты опредепения го мосерина в модельных растворах приведены в табп. 2. Испопьзование предпагаемого способа определения гомосерина методом газожидкостной хроматографии по предложенной методике повышает в 1,5-2 раза точность определения и сокращает время проведения анализа до 45 мин, т.е. в 68 раз. Тел1первтт«содержание rîìî- Ошибке (Общее рв ревнанн сернив опреаане- время акаваетипиро4 ння, шика, мин, опреаеBBNll$l, С расчетное.. 0TH,% ленное методом, Гжк, Ъ 95:-)561 Прсаолмеиие табл. 2 Ошибка опреаел ни и, отн.% Общее время анализа, Температура реакции ацетилнрования,е С Время реакции ацетнлирования, мин Соцержание гомосерина, гlп Концентрация ТФА в ацетоне, мас,% Образцы растворов гомосерина 4, Кукурузный экстракт 22,5 4,40 4,36 100 5 50 3 75 4 4,33 9,4 .1,1 9,36 1,7 9,33 1,2 6, Образец (llD л, 4) с цобаькой 5 г химически чистого гомооернна на 1 л образца 9,50 22,5 9,20 100 9,22 Известный 7-10 240-300 П р н м е ч а .н и е. Ошибка опрецелення не превышает 3,1% (относительных), Составитель В, Гладков Редактор A. Козориз ТехредМ.Рейвес Корректор И. Муска Заказ 6269/73 Тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент, r. Ужгород, уп. Проектная, 4 Ф ормупа изобретения Способ определения гомосерина, включающий газожидкостную хроматографию летучих производных гомосерина, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени анализа, анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-30 С и в случае опреде пения си нтетического гомосери на дополните пьно обрабатывают диазометаном с последующей газожидкостной хроматографией образующихся летучих производных. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М., "Мир, 1965, с. 393. 2. Берчфипд Г., Сторрс Ж. Газовая хроматография в биохимии. М., "Мир, 1 96 4, с. 53 4-53 6 (прототип ) .
