Способ определения нейротропной активности веществ

 

О Il И С А Н И Е ()996910

И ЗЬБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 30.03.79 (21) 2744784/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Кл.

G OI N 1/28

А 6! В 10/00

Гееударстеееный кеметет

Опубликовано 15.02.83. Бюллетень №6

Дата опубликования описания 25.02.83 (53) УДК 615.475 (088. 8) пв делам кзебретеккй и еткрытий ъ т11".р т;, ану т ., Й;;(..

-. Ь:- := 3 ф

:а, м иМ@щщям (72) Авторы изобретения

Е. Н. Соколов, П. М. Балабан, И. С. Захаров и С ъ Ф

: @»

Научно-исследовательский институт по биологичес

4 в химических соединений и Московский ордена Ленина ена-

Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. В. Ломоносова (71) Заявители (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ

ВЕЩЕСТВ

Изобретение относится к области выявления свойств веществ, а именно к выявлению нейротропной биологической активности и может быть использовано в медицинской и фармацевтической промышленности для массовых первичных испытаний веществ на биологическую активность.

Известен способ определения нейротропной активности веществ путем идентификации нейронов беспозвоночных (1) .

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности.

Известен также способ определения нейротропной активности веществ, заключающийся в том, что белым мышам внутрибрюшинно вводят испытуемые вещества в логарифмически возрастающих дозах (10, 20, 40, 80, 160 мг/кг и т. д.) и наблюдают за поведением животных (2) .

Недостатком этого способа являются большие экономические затраты на выявление одного вещества, обладающего нейро- 2О тропной активностью, вследствие большого расхода животных на испытание каждого вещества для получения достоверных результатов; невозможность полной автоматизации эксперимента, что приводит к низкой производительности способа, а также субьективность получаемых визуальным путем данных и косвенность оценки нейротропной активности вещества вследствие того, что регистрируются лишь изменения поведения животных без регистрации электрической активности мозга.

Цель изобретения — повышение точности способа и ускорение проведения исследовани й.

Цель достигается тем, что способу определения нейротропной активности веществ путем воздействия ими на биологический объект, в качестве биологического объекта используют виноградную улитку, при этом вещество растворяют в растворе Рингера и вводят- в мозг улитки, анейротропную активность определяют по регистрации электрическихх параметров нейронов.

Способ осуществляют следующим образом.

Центральную нервную систему улитки выделяют и помещают в ванночку с постоянным протоком раствора Рингера для холоднокровных животных. Соединительно996910

3 тканную оболочку ганглиев удаляют, ванночку помещают в экранированную камеру и под визуальным контролем в идентифицированные нейроны вводятся стеклянные микропипетки, укрепленные на микроманипуляторе типа ММ-I, соединенные через подводящий агаровый мостик и неполяризующиеся хлор-серебряные электроды с регистрирующим устройством, связанным с электронно-вычислительной машиной, обрабатывающей данные непосредственно в эксперименте. При этом регистрируются частота потенциалов действия, потенциалпокоя, возбудимость на внутриклеточное раздражение, вызванный ответ на ортодромную стимуляцию, действие на искусственную патологию нервной клетки. Возможна также регистрация соп ротивления мембра ны, реакции на аппликацию определенных медиаторов, пейсмеккерной активности при необходимости углубленного изучения действия вещества. Все параметры регистрируют до воздействия веществом, во время перфузии раствором испытуемого вещества и при отмывании через регулярные интервалы времени; они отражают динамику возникновения эффекта вещества и его исчезновения при отмывании. В случае стабильного эффекта берется средняя величина.

Концентрация веществ варьируется ступенчато от 10 М до 10 М. Концентрации веществ больше 10 2 М не исследуют, так как эффект достигается не специфическим физиологическим действием исследуемого З» вещества, а его концентрационным действием.

Все параметры регистрируют одновременно на четырех типах нейронов, описанных выше, так как при перфузии вещество действует на все нейроны одновременно.

Оценку действия вещества производят либо по изменению параметров при действии вещества, либо (Io сопоставлению регистрируемых параметров с действием на те же параметры применяющихся в клинике 40 лекарственных средств, механизм действия которых уже известен.

Время эксперимента по испытанию одного вещества составляет 2 — -4 ч в зависимости от особенностей исследуемого вещества. 4»

Вследствие хорошей воспроизводимости результатов, полученных на одних и тех же нейронах, для оценки нейротропной активности одного вещества достаточно двух опытов, т. е. восемь отведений активности нейронов у двух улиток, тогда как достоверные результаты в известном способепрототипе могут быть получены только при проведении 5 — 10 экспериментов, что требует затраты около 20 животных.

Пример. Раковину половозрелой вино- H градной улитки разбивают, извлекают центральную нервную систему и закрепляют ее в ванночке с восковым дном, в которой находится раствор Рингера для холоднокровных имеющий состав, мМ: NaCI 80;

КС! 4, СаС17, МдС1г 5, Трис 5, рН 7,4. Соединительнотканную оболочку снимают с llOверхности подглоточного комплекса ганглиев.

Интестинальный и правый паллиальный нервы накладывают на хлор-серебряные биполярные электроды, соединенные со стимулятором ЭСЛ-2 для нанесения транссинаптического раздражения.

Стеклянные микропипетки с диаметром кончика менее 0,5 мкм, сопротивлением

10 — 40 Ом, заполненные 2 М раствором цитрата калия, которые соединяются через агаровый мостик и неполяризующиеся хлор-серебряные конта кты со входом усилителя, вводят в нейроны. При этом автоматически начинается регистрация фоновой активности всех нейронов (частота спонтанных потенциалов действия и потенциал покоя) .

Перфузионная система, соединенная с ванночкой, обеспечивает постоянный проток через нее раствора Рингера.

Через 2 мин после начала регистрации на каждый нейрон через мостовую схему подают постоянный деполяризующий ток длительностью 5 с, а спустя 5 мин прикладывают напряжение Iv в течение 0,1 с на хлор-серебряные электроды (при этом регистрируют частоту потенциалов действия на внутриклеточное раздражение и вызванные потенциалы на транссинаптическое раздражение), после чего переключают перфузионную систему на раствор Рингера, содержащий натриевую соль дифенил гида нтоина в концентрации 10 4 М, при непрерывной регистрации электрических параметров — частоты спонтанных потенциалов действия и потенциала покоя.

Через !О мин после переключения перфузионной системы на каждый нейрон подают постоянный деполяризующий ток длительностью 5 с, а через 13 мин на хлорсеребряные электроды прикладывают напряжение Iv в течение 0,1 с. При этих операциях регистрируют соответственно частоту потенциалов действия на внутриклеточное раздражение и вызванные потенциалы на транссинаптическое раздражение.

Через 15 мин переключают систему. на чистый раствор Рингера, перфузию которым продолжают до возвращения параметров в первоначальное состояние, после чего перфузионную систему переключают на раствор Рингера, содержащий коразол в концентрации 0,5 вес. %, и регистрируют судорожные разряды. Через 5 мин после смены раствора через ячейку пропускают раствор Рингера, содержащий 0,5 вес. % коразола и 10 4 M натриевой соли лифенилгидантоина.

Затем, продолжая непрерывную регистрацию, поочередно через каждые 15 мин осуществляют аналогичные операции, ме996910

Составитель С. Малютина

Техред И. Верес Корректор Г. Решетник

Тираж 871 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3K — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 к

Редактор Л. Веселовская

Заказ 921/60 няя лишь концентрацию исследуемого вещества (5 10 4 и 10 з М).

Предложенный способ позволяет повысить производительность в результате полной автоматизации эксперимента, а также точность, сократить экономические затраты более чем в 30 раз и ускоритьпроведение исследований.

Формула изобретения

1О

Способ определения нейротропной активности веществ путем воздействия ими на биологический объект, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и ускорения проведения исследований, в качестве биологического объекта используют виноградную улитку, при этом вещество растворяют в растворе Рингера и вводят в мозг улитки, а нейротропную активность определяют по регистрации электрических параметров нейронов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Kandel E. R. Cegntar basis of aehavior.

San. Fr. Freeman, 1976, р. 11 — 16. 2. Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. М., «Медицина», 1976, с. 83 — 99.