Способ получения 5-дезоксирибомононуклеотидов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5--ДЕЗОКСИРИБОМОЯОЯУКЛЕОТИДОВ из дезоксирибонуклеиновой кислоты, включающий ее гидролиз в присутствии нуклеаз при нагревании с последующим йыделенкем цёЛсжого продукта, отличающийся тем, что, с целью одновременного получения 5 -дезоксирМСоди-и 5 -деэоксирйботринуклеотидов, гидролиз осуществляют в присутствии нуклеазы, вьшеленной иэ бактерии 6errat4o шагсепэсепз при 25 - , рН 8,1 8,5, времени инкубации 2 - 18 ч. в соотношении исходного сырья и нуклеазы 1:200. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР .

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3380476/28-13 (22) 23.10.81 (46) 15.11.83. Бюл. Р 42 (72) И.Д.Батурина, H.Ï.Áàëàáàí, Г.Д. Бердышев, М.H. Филимонова,Д.B.IOcyпова и H.À.Ëóöåíêî (71) Киевский ордена Ленина государственный университет им. Т.Г.Шевченко и Казанский- ордена Ленина и ордейа

Трудового Красного Знамени государственный университет им. В.й.ульянова-

Ленина (53) 61".45(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР 9 203837, кл. С 12 Э 13/06, 1966.

2. Авторское свидетельство СССР

9 534236, кл. A 61 К 37/107, 1975.

3(51).A 61 К 37 10) С 12 Р— 30 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНЦЯ 5 -ДЕЗОК=.

СИРИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ из дезоксирибо- . нуклеиновой кислоты, включающий ее гидролиз в присутствии нуклеаэ при нагревании с последующим выделением целового продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью одноврЕменного получения 5 -дезоксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотвдов, ( гидролиз осуществляют в присутствии нуклеазы, вЫделенной из бактерии

Serratia Есц-сЕПеСЕ))Б, прн 25 — 37 ос, рН 8,1 - 8,5, времени инкубацнн

2 — 18 ч. в соотношении исходного сырья и нуклеазы 1:200.

3053832

Изобретение относится к полученик биологически активнын, веществ, а именно 5 -дезоксирибомоно-, 5 — деэоl ксирибоди-и 5 -деэоксириботринукле/ отидов, которые находят применение в медицине в качестве лечебных препа- 5 ратов и физиологически активных веществ, в научных исследованиях в качестве объектов и инструментов исследования, в пищевой промышленности для улучшения вкуса, придания аромата мяса и повышения питательной ценности ряду растительных пищевых продуктов.

Известен способ получения 5 -моноf нуклеотидов нуклеиновых кислот, заключающийся в ферментативном гидро-. лиэе нуклеиновой кислоты, при этом расщепление н„ клеиновой кислоты осу° ествляют с помощью Фосфодиэстераз, выделяемых актиномицетатами в культуральную жидкость в ходе Фермента. ции fl) .

Однако известный способ не позволяет получить целевой продукт с высоким выходом и удовлетворяющей

25 чистотой.

Известен также способ получения

5 -дезоксирибонуклеотидов из. деэоксирибонуклеиновых кислот, включающий их гидролиз с помощью нуклеаэ, выделенных из печени морских промысловых рыб при 37 С в течение 24 ч. и при рН 7,0 с последующим выделением целевого продукта (2j .

Известный способ не обеспечивает одновременного получения 5 дезокси- 35 рибомоно-, 5 -деэокскрибоди-и

5 -дезоксириботринуклеотидов.

Цель изобретения — одновременное получение 5 -дезоксирибоди-и

5 -дезоксириботринуклеотидов.

Г l

4р

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения

-5 - дезоксирибомононуклеотидов из дезоксири бомононуклеи новой ° кислоты,, включающем ее гидролиз в присутствии нуклеаэ при нагревании с последующим выделением целового продукта,.гидролиз осуществляют в присутствии нуклеазы, выделенной из бактерии5Ер п(лп тагсеБсеоэ при 25 — 37 С, рН 8,1-8,5, времени инкубации "-18 ч и соотношении исходного сырья и нуклеаэы 1г200, Выделение фермента иэ культуральной жидкости 441ryg ryan дга Ви 211

ATCC-9986 штамм Р 24 осуществляют следующим образом. 5

Культуру выращивают на полусинтетической среде в течение 2 сут при

27 С в конических колбах с интенсивной аэрацией при перемешивании (на качалках 70-8 О об/мин) . Посев про- 60 изводят односуточной культурой из расчета 0,5-1 млн. клеток на 1 мл среды. Состав среды для выращивания, Ъ : глицерин 0,5; цитрат аммония

О, 5 Р К Н Р04 1 У M+040, О 5 ) Na C0 О t 0 5;FAP, 0 06; 65 гидролиэат .казеина О,li дрожжевой автолизат 0„3 при рН 7,5, По окончании выращивания бактериальные клетки удаляют центрифугированием, а из надосадочной жидкости выделяют нуклеаэу с помощью фракцио-нирования сульфатом аммония (90%. насыщения) и последующей очистки на двух монообменных колонках .

Первая колонка с ДЭАЭ-целлюлозой.

Проводят пропуск ание ферментного раствора (сульфат-аммонийная фракция нуклеазы после диализа и центрифугирования) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,2. При этом весь ферментный белок не задерживается колонкой, на ней остается большая часть баллаcòных белков, содержащихся в сульфатаммонийной фракции наряду с нуклеазой.

Вторая колонка с фосфоцеллюлюэой.

Проводят пропускание ферментного раствора (фракция после очистки на

ДЭАЭ-целлюлозе) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,2. В этих условиях нуклеаэа спецнфически сорбируется ионообменником, а большая часть балластных белков не задерживается колонкой и выходит иэ нее при .нанесении и последующей промывке буфером. Элюция ферментного белка осу*ществляется 0,2 М натрий-eöåòàòêûì буфером, рН 6,2.

В процессе очистки нуклеазы и сульфа:-аммонийной фракции ак". âí;ë" ть фермента контролируют по начальной скорости образования кислотораствори.— мых продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновой киелоты (ДЯК) под влиянием выделяемой нуклеазы. За единицу. актив,ности принимают количество Фермента, которое дает увеличение поглощения ультрафиолетовых лучей при 260 нм продуктами гидролиэа ДНК, ра",Tíoðèìûми в 4% НЖ04, равное 1 оптической единице, в пересчете на 1 мг фермента

3a l ч инкубации при 37 С (ед/мг/ч, A 260) . Инкубационная проба объемом

1 мл содержит 1 мг ДЯК; О,,I М трисНС0 буФер, рН 8,5; 0,007 М Mg504 и

0,1 мл ферментного раствора в таком разведении, которое обеспечивает начальную скоро:ть прохождения Фермен-. тативнoro ."идролиэа субстрата, II р и м е р. Берут 10 мг ДЯК тимуса крупного рогатого скота (или из гюбого другого источника), растворяют в 10 мл дистиллированной воды и добавляют 8 мл 0,25 М таис-НОР. буфера,рН 8,5, содержащегo 0,0175 М

M)50< . Затем вносят 0,1 мл раствора. фермента, разведенного таким образом, чтобы йа 1 мг ДНК в инкубируемой пробе приходилась 2500 ед, активности фермента (на 1 мг ДНК вносят 5 мкг нуклеазы, обладающей удельной актив1053832 ностъю 5000001 . Гидролиэ проводят при 37 С ч или при 25 С 18 ч (при этом соблюдаются условия исчерпывающего гидролиза субстрата в присутствии избыточного количества ферментного препарата) . По окончании процесса ферментативного гидролиза ДЯК гидролизат прогренают при 90 С 15 мин для инактивации и денатурации фер= ментного белка, а появившуюся при этом легкую мутность удаляют центри- 10 фугированием (5000 об/мин, 15 мин) .

Разделение смеси 5 -дезоксирибонуклеотидон осуществляют известный способом, например методом ионообменной хроматографии на колонках. 15

Берут 18 мл гидролизата ДНК, попученного описанньм способом,что сос-. тавляет 300 оптических единиц поглощающего ультрафиолетовые лучи при

260 нм материалами и наносят на ионообменную колонку (2x17 см, объем

38 мл), содержащую ДЭАЭ-целлюлозу в ацетатной форме, рН 4,7. Колонку промывают дистиллированной водой, затем 7 М мочевиной, приготовленной на натрий-ацетатном буфере, рЯ 4,6 . (в 1 л раствора 7 М мочевины содержится 25 мл 0,1 M натрий-ацетатного. буфера, рН 4,7), до снижения рН Вытекающего из колонки буФера до .

6,2-5,3. По окончании промывки

5 -дезоксйрибонуклеотиды элюируют с колонки в порядке увеличения ихполимерности градиентом возрастаю+ щих концентраций)(ОС . Объем градиен" . та (750 мл 7 М моченины+натрий-аце- Зэ тат, рЯ 4,7,+ ОМЙаС1) +(750 мл 7 М моченины + натрий-ацетат, рН 4,7,. +

+ 0,3 М h(aC(,) . Вытекающий из колонки элюат собирают по фракциям и анализируют,спектрофотометрически при. 40 60 нм. Объем фракции 15 мл, скорость элюции 150 мл/ч. С колонки элюирова— но пять фракций пиков в ещес тв, поглощающих ультрафиолетовые лучи при.

260 нм. В элюате в сумме определено

94-97% материала от количества, нанесенного на колонку. При увеличении. ионной силы элюирующего раствора до .

2 N йаСФ (после окончания градиента) с колонки не снимается дополнительно материал, поглощающий при 260 нм.

Каждая из пяти,ракции неществ (н отдельчости) обессоливается от мочевины и МаССв колонке с ионооб-. менником и подвергается анализу и .. характеристике. . 55

Обессоливание полученного материала проводят. следующим образом.

В фракции, составляющие каждый пик, объединяют по пикам, разводят 3-.5 60 объемами дистиллированной воды и доводят рН до 8,0. Затем каждый пик (в отдельности) пропускают через, ДЭАЭ-целлюлозную колонку (в карбонатной Форме) . Объсм колонки для каждого Я пика под ирают из расчета, что

0,2 ммоль нуклеотидного материала сорбируют íà. ;у объемом 90 мл.

Колонку промывают большим объемом дистиллированной воды (5 объемон колонки), затем 0,02 M карбонатом аммония (pH 8,4) до отсутствия ионов хлора в вытекающем буфере (проба с нитратом .серебра) . Затем нуклеотиды элюируют с колонки 0,7 M карбонатом аммония (рН .8,4) . Обессоленный элюат нуклеотидных фракций концентрируют под вакуумом на роторном испарителе при температу-ре водяной бани не выше

30 С (или лиофильно высушивают) . К о сухому остатку добавляют небольшой объем ноды .(3-.5 мл) и снова высуши-. вают тем же,образом . Процедуру повторяют до:полного удаления карбоната аммония (обычно 3 раза) .

Обессоленные фракции идентифицируют по порядку элюции и ионной силе снятия каждой фракции с колонки, по отношению .концевого фосфата.к общему фосфору, по снижению отношения нели-. чины оптической плотности при 260 нм (E) к фосфору (P) с повышением длины алигбнуклеотида, по спектрам поглощения н .ультрафиолетовой области (220 - -300 нм); по наличию дезоксирибозы в каждом пике, определяемом с дифениловым реактивом.

Результаты анализа материала, элюированного с ДЭАЭ-целлюлозы при хроматографическом разделении гидролизата ДНК, полученного с помощью нуклеазы5еггМ(б вггсезсепь штамм 9 24, приведены в таблице.

Результаты, аналогичные приведенным в таблице, получают при гидролизе 1 r а также 10 г ДНК при соответствующем увеличении объемов инкубационной смеси и количества нуклеазы, используемой для ферментативного расщепления субстрата, а также при соответствующем увеличении объема колонки с ионообменником, ис" пользуемым для фракционирования гидролизата ДЯК и объемов всех рабо(чих буферных растворов .

Идентичные результаты получены на всех испытанных препаратах ДЯК

1 отечественного производства, возможно широкое применение предлагаемого способа получений 5 - дезоксирибонуклеотидов в промьпаленных масштабах с использованием в качестве субс трата ДНК отеч еств енноГо прои зводстн. /

Полученные в результате хроматографическ ого разделени я гидролиза та

ДНК. на ДЭдЭ-целлюлозе фракции., пред,ставляющие собой смеси моно-, ди-и тринуклеотидов, при необходимости могут быть легко разделены на индивидуальйые компоненты внутрй каждой фракции с помощью ионообменной хромато-.

1053832

Количеств о материала в пике, Ъ от нане сенного

Порядок выхода пиков с колонки

Ионная си- Е/Р ла снятия ммоль, и аС0

Наличие арактер дезокси- спектра рибо

Идентификация пика

4;4

1 3-20

27, 6-36,2

Нет P Нет

Яе нуклео-Примеси в ДЯК тидный

Нуклеотид-Яуклеозиды, ный основания

3,3

Есть

20,3

49, 2-65,4 9, 989 -. 1, 12

71,8-87,7 8,205 1,98

94,2-116,6 7,782 3,21

5 -мононуклеотиды

5 -динуклеотиды

5 -тринуклеотиды

25,6

27,0

Составитель В. Брусйловская

Редактор Л.Алексеенко Техред И.Гергель

Кооркккор A.ÏýHTêo

Подписное

Заказ 8961/4 тираж 713

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная,4 графин íà t Дауэксе в известных условиях. Кроме того, фракции ди-и тринуклеотидов могут быть подвергнуты ферментативному гидролизу в известных условиях с целью получения из них индивидуальных мононуклеотидов .

Иэ приведенных данных следует, что использование 5 -эндонуклеазы

3erratia rnarcensce,штамм 9 24 для гидролиза промышленннх препаратов ДНК с целью получения 5 -дезоксирибонукле- 10 отидов по предлагаемому способу экономически выгодно, так как указанную нуклеазу выделяют из культуральной жидкости бактерий5еггаОа tnarcescene штамм Р 24, который является сверхпродуцентом данного фермента. Благодаря черезвычайно высокой продуктивности данных бактерий гарантируется получение в больших количествах препарата нуклеазы, активность которого ) в 20 и более раз превосходит активность препарата панкреатической

5 ДНКазы. Высокая активность нукла3H8eOvatiamarcescens. штамм 9 24( (500 тыс .сп . ед/мг) позволяет использовать очень малые количество фермента для гидролиза ДНК (на 1 г ДЯК расходуется 2,5 млн ед. активности, что составляет около 5 мг ДЯКаэы), а гидролиэ проводить в экономичесски рентабельных условиях и получать высокочистный целовой продукт с высоким вых одом . к

Суммарный выход отдельных изоплит

5 -деэоксирибонуклеотидов, полученных по предлагаемому, способу, составляет 95-98% от количества кислоторастворимого материала гидролизата (80-85% составляют индивидуальные фракции, а 15-20% содержится в зонах перекрытия пиков при их разделении на ионообменниках) . Фракции 5 -дезоксирибонуклеотидов характеризуются высокой чистотой и гомогеыностью, о чем свидетельствует симметричность пиков при монообменной хроматографии, а также результаты спектрального и химического анализа фракций.