Штамм бактерий @ @ @ -20-продуцент глицеролдегидрогеназы, окисляющий глицерин в диоксиацетон

 

Шта№{ бактерий Gluconobacter oxydans D-20 (коллекция Цеитрального музея промьшшениьос микроорганизмов Всесоюзного научио-исследоватепьского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЩШМ В-2520) - продуцент глицеролдегидрогеназы окисляющий глицерин ;в диоксиацетон.

сОюз советских

О 3 °

ЩС ВБЛИК

4(50 госудю ственный комитет ссс1

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ .N aBTOPCNI3IIOV CÂÈ@Å ÅË Ñ àì (21) 3568323/28-13 (22) 14.02.83

:(46) 30.04.85. Бюл. В 16 (72) М.B. Оверченко, В.А. Янсон, Г.М. Добролинская, З.А. Виестуре, А.А. Хагендорф и Д.Р. Жигуре (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (53) 577. 15(088.8) (56) 1, Авторское свидетельство СССР

В 418522, кл. С 12 Р 7/26, 1972.

2. Авторское свидетельство СССР

;Ф 789581, кл. С 12 Р 7/02, 1978

:(прототип).

„„SU„„1110171 А (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ СЫСОЯОВАСTER ОХУЭАЯЗ В-20-ПРОДУЦЕНТ ГЛИЦЕРОЛ.

ДЕП1ДРО1.ЕНСЫ, ОКНСЛЯ@ШИЙ XmqsmH

В ДИОКСИАЦЕТОН. (57) Штамм бактерий OIveonobacter

ozydans 9-20 (коллекция Центрального музея промыншеннык микроорганизмов

Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов., коллекционный но" мер ЦМПМ В-2520) - продуцент глице- . ролдегидрогеназы, окисляющий глицерин

;в диоксиацетон.

1110171

Изобретение относится к микробиологической промьпплености и представляет собой штамм культурь> бактерий

Gluconobacter:oxydans D-20 для промышленного получения диоксиацетата, применяемого в пищевой промышленности и медицине. Известна культура бактерий Acetobacter aceti-продуцент глицеролдегидрогеназы, окисляющий глицерин в диоксиацетон P) ..

Наиболее близка к предлагаемой культура бактерий Acetobacter Suboxydans " продуцент внеклеточного фермента глицеролдегидрогеназы катализирующий окисление глицерина строго избирательно по вторичной гид роксильной группе в диоксиацетон.

Бактерии G.oxydans хорошо развари ваются на средах с глицерином, который как источник углерода обеспечивает осуществление их энергетических и синтетических процессов. Эта культура хранится в коллекции микроорганизмов биологического факультета

Ленинградского государственного университета и является прототипом изобретения (?) .

Бактериальные клетки этой культуры имеют палочковидную форму, средние размеры клеток 0,5 — 1,2 мкм, размножаются делением, споры не образуют, склонны к образованию длин-, ных цепочек. Бактерии-каталазоположительные облигатные аэробы. Ассимилируют глюкозу, лактозу, мальтозу, галактозу, глицерин, этанол, метанол пропанол и другие спирты. Характертерна ссобенность ассимилировать уксусную кислоту. Этот штамм используется для получения уксусной кислоты на спирте, глюконовой или котоглюконовой кислоты из глюкозы, сорбозы иэ сорбита. Штамм способен окислять глицерин в концентрации не более

2Х до диоксиацетона при температуре о

30.С в течение 48 ч. Выход диоксиаце тона — 98, определенный по результатам анализа. Однако данный штамм не может найти промышленного применения для получения диоксиацетона в связи с его неспособностью окислять высокие концентрации глицерина (2X).

В связи с этим процесс производства диоксиацетона с применением этого штамма является низкопроизводительным .

Целью изобретения является получение активного штамма G.oxydans, 20 способного окислять глицерин при концентрации последнего в среде

10-20Х.

Данный штамм был выделен-селекционным путем воздействия высоких концентраций глицерина на исходную культуру бактерий G.oxydans, полученную иэ Ленинградского государственного университета.

Ниже приведена схема селекции штамма G.oxydans D=20:

Gluconobacter oxydans ЛГУ

Отбор на способность окислять

6Х глицерина

Отбор на способность окислять

10Х глицерина

Отбор на способность окнслять

15Х глицерина

Отбор на способность окислять

20Х глицерина, штамм G,oxydans

D=20 °

Предлагаемый штамм Д=20 отличается от исходного штамма не только значительно большей способностью окислять глицерин, но рядом морфологических и физиологических признаков.

Данный штамм хранится в коллекции Центрального музея промьппленных микроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции под коллекционным номером В-2520.

Морфологические признаки.

Бактериальные клетки имеют палочковидную форму, средний размер клетки 0,6 х 1,2 х 1,6 мкм. Размножаются делением, спор не образуют, формирование цепочек наблюдается редко. Инволютные формы проявляются в виде сильно увеличенных клеток .

На агаризованной, среде с глицерином образуют мелкие выпуклые круглые гладкие блестящие колонии без

45 пигментов. На поверхности жидкой среды через 24 ч образуют тонкую прозрачную полисахаридную пленку, Физиолого- биохимические свойства .

5Î

Бактерии каталазоположительные

У облигатные аэробы, Молодые клетки грамотрицательны.

Оптимальная температура для окисления глицерина до диоксиацета55 та — 28-30 С рН 5 5.

Э, У

Отношение к углеводам. Бактерии

С.oxydans D=20 хорошо ассимилируют глюкозу, мальтоэу, галактозу, раффинозу.

1110171

15,0

Пример 2. Для проведения ферментации в укрупненных лабораторных условиях посевной материал готовили следующим образом. Суспензию клеток односуточной культуры G.îõó-.

dans D 20 из одной пробирки вносили в колбу Эрленмейера емкостью 750 мл, 5S снабженную четырьмя отбойниками, содержащую 100 мл питательной среды следующего состава, мас.X:

Отношение к спиртам. Ассимилируют глицерин, этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, изобутанол, пентанол, сорбит, маннит.

Отношение к уксусной кислоте.

Не ассимилирует.

Пример 1, Окисление глицерина в диоксиацетон проводят следующим образом. Для подготовки посевного материала суспензию клеток

G.oxydans D=20 из одной пробирки (возраст культуры — одни сутки) в асептических условиях вносят в колбу Эрленмейера с четырьмя отбойниками объемом 750 мл, содержащую

50 мл посевной среды следующего состава, мас.X:

Глицерин

Кукурузный экстракт

20 (50X- сухих веществ) 1,25

КП, Рг 0,3

Мр,зо„ 0,029 рН среды 5,5-5 7

Выращивание посевного материала . ф проводят в течение 16-20 ч при 30 С до содержания диоксиацетона в среде

6,0-8,0%.

Посевным материалом в количестве З0

2Х засевают среду для ферментации следующего состава, мас.%: .

Глицерин 15,0

Кукурузный экстракт 35 (507. сухих веществ) 0,63

КН<РО< 0,5 рН среды 5,5-5,7

Ферментационную среду разливают щ по 100 мп в колбы Эрленмейера четырьмя отбойниками объемом 750 мл. Ферментацию осуществляют на- качалке (180 — 200 об/мин) в течение 48 ч.

Содержание диоксиацетона в среде 45

14,4 — 14,77, что составляет выход

98-1007 от теоретического.

Глицерин

Кукурузный экстракт (507 сухих веществ) 1,5

КН Р04 0,3 мя 804 0,025 рН среды 5,5-5,7

Выращивание посевного материала осуществляют на качалке (180200 об/мин) при 30 С в течение

24 ч до накопления в среде 7,0-8,0Х диоксиацетона.

Окисление глицерина в диоксиацетон проводят в ферментере емкостью

30 л (рабочий объем 20 л), имеющем сульфитное число, равное 10 r О л/ч .

Питательная среда для ферментации имела следующий состав, мас.Х:

Глицерин 2 О, 0

Кукурузный экстракт (50% сухих веществ) 0,75

КН Р04 0,5 рН среды . 5,5-5,7

После стерилизации и охлаждения о среды до 30 С ее засевают посевным материалом в количестве 1%.

Ферментацию осуществляют в те-" чение 72 ч при 30 С. 3а это время окисление глицерина до диоксиацетона проходит на 96Х, что составляет

3,75 кг диоксиацетона.

Удельная производительность ферментера составляет 62,7 кг 100%-ного диоксиацетона с 1 м оборудования в сутки.

Удельная производительность фер-. ментера рассчитывается по формуле ю,.К и где » — удельная производительность ферментера

Юг — количество глицерина, взятого на окисление, кг, коэффициент перевода рабочего объема ферментера. на .1 м, — выход диоксиацетона при окислении глицерина, — срок ферментации, сутки, 1,02 — коэффициент пересчета глицерина на диоксиацетон.

Пример 3. В производственных условиях посевной материал гоговят в инокуляторе емкостью 10 л, 1110171

Предлагаемыйй штамм

Прото" тип

Показатели

Концентрация диоксиацетона, образующегося . в результате действия штамма,7

t5-20

Выход диоксиацетона, Х

95-98

Удельная производительность оборудо" вания, кг/м сутки

48-63

Составитель И. Привалова

Редактор О. Юркова Техред T.Ôàíòà . Корректор О. Билак:, Ю

Заказ 2810/2 . Тираж 525 Подписное

ВВИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фв ч

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4..

В заполненном 6 л питательной среды, имеющей состав, как указано в примере

Для засева инокулятора используют культуру G.îõóéàïs D-"20, выращенную 5 в колбе, как описано в примере 2.

Ферментер емкостью 1 м (рабочий объем 600 л), снабженный якорной мешалкой, делающей 180 об/мин и обес,печивающей аэрацню f объем воздуха, 10 на один объем среды в минуту. Производственная питательная среда. для ферментации имеет состав, как. указано в примере 1.

После стерилизации и послео

И дующего охлаждения среды до 30 С ее засевают посевным материалом из инокулятора. Ферментацию осуществляют в течение 72 ч. За это .время окисление глицерина проходит 2Е на 94,5Х. Удельная нроиэводительность Ферментера составляет 47,5 кг/м

I» в сутки.

В таблице приведены сравнительные. показатели предлагаемого штамма с 25 прототипом,.

Таким образом, преимущество предлагаемого штамма для промышленного получения диоксиацетона заключается в уве лнченни концеитрацнидиоксиацетона..

Предлагаемый штамм позволяет получать культуральную жидкость, содержащую высокие концентрации диоксиацетона, что упрощает процесс выделения конечного продукта, снижает трудоемкость процесса.