Способ получения 3-0-/ @ - @ -глюкуронпиранозил/- соясапогенола @

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0-(/3-I)-ГЛЮКУРОНПИРАНОЗИЛ )-СОЯСАПОГЕНОЛА 5 формулы I отличающийся тем, что соединение формулы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (у) С 07 3 63/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ.И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТ,Ф

ОН

СООН

СН,0Н

ОН

ОН

HO 0H (21) 2954186/23-04 (62) 2745040/23-04 (22) 31.07.80 (23) 30.03.79 (31) 38536/78 (32) 31.03.78 (33) JP (46) 07.11.85. Бюл. )). 41 (71) Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд(ЛР) (72) Иасанао Синохара, Есимаса

Накано, Хироцугу Каисе, Такетоси Изава и Васеи Ииязаки (JP) (53) 547.689.6.07(088.8)

;.(56) Jasuhivo Ariga Hiroyoki Sumi. ..)спасо Takada. Akikazu Takada, Abridgementi of lecture Programs on

Seminar of the Plasmin Research Association 65, 1977.

Heneki Kagaku -(Jmmuno — Chemistry),Juichi Jamamura etal. Ed Asakura

Shoten. Tokyo, Japan, 1973, р.830834. (54) (57) СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0-(р-z)

-ГЛЮКУРОНПИРАНОЗИЛ) -СОЯСАПОГЕНОЛА б формулы отличающийся тем, что соединение формулы где R — С -Сб алкил, гидролизуют при 50-110 С в течение

1-6 ч и соединение формулы I выделяют из! гидролизата.

1 1190989

Изобретение относится к способу получения нового производного соясапогенола 8 именно 3-0-(/3-D- глюкуронпиранозил)-соясапогенола В формулы

f 1О

COOH сн он обладающего антикомплементарной активностью, Цель изобретения — разработка способа получения нового соединения 3-0- (P-D-глюкуронпиранозил)-соясапо- 20 генола о, обладающего преимуществами в фармакологической активности перед глицирризином, Пример 1.

А. Соясапонин В (500 г) растворя- 25 ют в 30 мл метанола. После добавления 1,5 мл 15 н. серной кислоты раствор нагревают с обратным холодильником в течение 3 5 ч. К реакционной смеси добавляют холодную воду для образования осадка который соби) рают и промывают обильно водой. Преципитаты адсорбируют на колонке силикагеля и проявляют смесью хлороформа и этанола поочередно (20: 1 по объему 200 мл; 1 0: 1 по объему 1 50 мл, 5:1 по объему 200 мл и 2:1 по объему

200 мл) для получения 71 мг 3-0-(6-0-метил- -D-глюкуронпиранозил)-соясапонина р.

Полученное соединение растворяют в 2 мл метанола и 2 мл 1 н. водного раствора едкого натра добавляют к первому раствору с последующим нагре-45 ванием с обратным холодильником в течение 2 ч. После этого реакционную смесь смешивают с холодной водой, .значение рН устанавливают равным 1 с помощью 1 н. водного раствора со- 50 ляной кислоты и экстрагируют н-бутанолом, Фракцию н-бутанола концентрируют досуха при пониженном давлении. Кристаллизацией остатка из смеси хлороформа и ацетона (в отноше- 55 нии 1:1 по объему) получают 50 мг

3-0-(D-глюкуронпиранозил)-соясапогено" ла р т.пл. 231-232 С (с разл.)..

Вычислено, X: С 68, 11, Н 9, 21.

С 6 Н 80з

Найдено,X: С 67,85; Н 9,08

Тонкослойная хроматография на силикагеле с использованием "Kiesel Geb F. "

25+ (коммерческое название для силикагеля компании Merck).

1. Хлороформ-метанол-вода (при объемном отношении 65:35:8).

R<=- 0,38.

2. Изопропанол-2 н. водный раствор аммиака (при объемном отношении 100: 15) Р = 0,21.

Растворимость . хорошо растворим в метаноле, этаноле, н-пропаноле, н-бутаноле, водных растворах щелочей, пиридине, диметилсульфоксиде и диметилформамиде> растворим в ацетоне, этилацетате и метилэтилкетоне, слабо растворим в бензоле, хлороформе,- диэтиловом эфире, н-гексане и петролейном эфире.

Б. Соясапонин В (500 мг) растворяют в 30 мл этанола, насыщенного хлористым водородом, и раствор кипятят с обратным холодильником в течение

3 ч. К реакционной смеси добавляют холодную воду.для осаждения преципитата, который собирают и промывают водой. Затем осадок очищают на колонке силикагеля методом хроматографии (растворитель для элюирования: смесь хлороформа и этанола в объемном отношении 20:1,10: 1, 5:1,2:1) и получают 75 мг 3-0-(6-0-этил-D-глюкуронпиранозил)-соясапогенола В.

Полученное соединение смешивают с 2 мл этанола и 2 мл 1 н. водного раствора едкого кали и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь смешивают с холодной водой, устанавливают рН около 1 с помощью 1 н. водного раствора соляной кислоты с последующим экстрагированием н-бутанолом. Фракцию н-бутанола выпаривают досуха в вакууме и кристаллизуют остаток из смеси хлороформа и ацетона (в объемном отношении 1:1). Получают

45 мг 3-0-((-D-глюкуронпиранозил)-соясапонина В,.т.пл. 231-232 С (с разл.).

Пример 2. Соясапонин В (1 r) растворяют в 70 мл дистиллированной воды и раствор смешивают с 5 мл 15 н. водного раствора соляной кислоты, с последующим кипячением с обратным холодильником в те1190989 чение 2,5 ч. Реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом. Фракцию н-бутанола выпаривают досуха под вакуумом. Остаток адсорбируют на колонке силикагеля и проявляют смесью 5 хлороформа и этанола (в объемном отношении 20 . 1, .10: 1, 5: 1, 2: 1) .

Получают .350 мг 3-0-tI-D-глюкуронпиранозил)- соясапонина В, т.пл.231. 232 С (разлагается). 10

Пример 3. 3-0-(6-0-Метил-P-D-глюкуронпиранозил)-соясапогенол о (70-мг) добавляют к 2 мл диоксана и к смеси добавляют 1;5 мл 15 н. .

Н БО . Результирующую смесь нагре-. 15 вают с обратным холодильником в течение 2,5 ч.,Реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом и н-бутанольную фракцию концентрируют до сухого, остатка при пониженном давлении.. 20

Остаток, адсорбируют в. колонке с силикагелем и проявляют смесью хлороформэтанол в последовательности 20:110:.1-5: 1-2." 1 (по объему) с получением 24 мг 3-О-(p-D-глюкуронпирано- 25 лиз) соясапогенола В, т.пл. 231-

232 С. (с разл.).

Пример 4. Р.аствор 1 г с оясапонина" б в 70 мл дистиллированной воды смешивают с 5 мл водного . раствора:, в котором содержится 3,6 r трифторуксусной кислоты, и смесь нагревают. с. обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом. Н-бута35 нольную фракцию Концентрируют до сухого остатка при пониженном давлении. Остаток адсорбируют в колонке с силикагелем и проявляют смесью хлороформ — этанол в последователь- . 4О ности 20 .1-10:1 -5:1-2:1. (по объему) с полу ением 175 мг 3-О-(P-Dглюкуронопиранозил)-соясапогенола В, т.пл .. 231-232 С (с разл.).

П р и м"е р 5. 3-0-(6-0-Метил-(3-. 5

-D-глюкуронпиранозил)-соясапогенол Ь (70 мг) добавляют к 2 мл воды и к смеси добавляют 1,5 мл концентрированной соляной кислоты. Полученную смесь нагревают при 50 С в течение .5р о

6 ч. Реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом .и фракцию-н-бутанола концентрируют досуха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на силикагеле вколонке нпроявляют смесьюхло- 55 роформ - этанол последовательно составами (20:1, 10:1, 5:1, 2:1.по объему) с получением 22 мг 3-0-(P-D-глюкуронпиранозил)-.соясапогенола

В, т.пл. 231-232ОС (разложение).

Пример 6. 3-О-(6-О-Метил-15-D-глюкуронпиранозил)-соясапогенол

В (70 кг) добавляют к 2 мл диметилсульфоксида и к смеси добавляют 2 мл

1 н. водной гидроокиси натрия. Полуо ченную смесь нагревают при 110 С в течение 2 ч. После смешения реакционной смеси с холодной водой и доведения значения рН до 1 с помощью 1 н. водной соляной кислоты, реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом и фракцию н-бутанола концентрируют до- . суха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке с силикагелем и проявляют смесью хороформэтанола последовательно составами (20:1, 10:1,5:1,2:1 по объему) с получением 3-0-(P-D-rsnozypovnqpano-.

o зил)-соясапогенола В, т.пл .231-232 С .(разложение).

Пример 7.. 3-О-(6-0-Метил-/3

-D-глюкуронпиранозил) -соясапогенол В (70 мr) добавляют к 2 мл диметилформамида и к смеси добавляют 3 мл

1 н. бикарбоната натрия. Полученную о смесь нагревают при 90 С в течение

3,5 ч. После смешения реакционной смеси с холодной водой и доведения значения рН до .1 с помощью 1 н. водного раствора соляной кислоты, реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом и фракцию н-бутанола концент- ° . рируют досуха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке с силикагелем и проявляют смесью хлороформ-этанол последовательно составами (20: 1, 10: 1, 5:,1, 2: 1 по объеМу) с получением 27 мг. 3-0-(/3-D-rsdoкуронпиранозил)-соясапогенола B т.пл. 231-232 С (разложение .

Пример 8. 3-О-(6-0-Метил-P-D-глюкуронпиранозил)-соясапогенол

В (70 мг) добавляют к 2.мл тетрагидрофурана и к смеси добавляют

45 мл. 1 н. карбоната калия. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч. После смешения реакционной смеси с холодной водой и доведения значение рН до 1 с помощью 1 н. водного раствора соляной кислоты, реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом и фракцию н-бутанола концентрируют досуха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке с силикагелем и проявляют смесью хлороформ1190989

Та блица 1

АнтикомплеменОстрая токсичность

JIg мг/к г

Соединение тарная активность /мл

Более .300

500-1000

Более 300 этанол последовательно составами (20 :1, 10 .1, 5:1, 2:1 по объему) с получение 19 мг 3-О-(t)-D-глюкуронпиранозил)-соясапогенола В, имеющего температуру плавления 231232 С (разложение).

Предлагаемые..соединения обладают ,антикоплементарной активностью и . используются в качестве. лечебных .средств при аутоиммунных заболеваниях.

Фармакологические испытания.

Испытываемые соединения:

А. 3-..0-(P-D-глюкуронпиранозил)-

-соясапогенол 8.

Б. Глицирриэин (соединение для сравнения).

Антикомплементарная активность.

Испытания заключаются в следующем. В пробирку загружают по 0,5 мл водной дисперсии каждого из испытываемых соединений, по 0,5 мл сенсибилизированнЬ х эритроцитов (СЭ),при этом .культура .содержала 1х10 клеток/мл, 1 мл пятикратно разбавленного буферного раствора веронала, содержащего изотонический желатин (Этот 5-кратно разбавленный раствор для краткости назван ЖВБ) и по

0,5..мл комплемента сыворотки (комплемент морских свинок) разбавленного 1 50 раз. ЖВД. Смесь выдержива-. ют при 37 С в течение 60 мин. Затем к ней добавляют 5 мл ледяйого . физиологического раствора. и смесь центрифугировали. Спектральная паглощательная способность отделенного верхнего слоя определялась при ОП,и измерялась степень ингибирования гемолиза сенсибилизированных эритроцитов испытываемыми соединениями. 507 значение ингибирующей гемолиз активности ((/мл), измеренное предлагаемым методом, показано:в .табл. 1 для каждого испытываемого соединения.

Острая токсичность.

Острая токсичность (ЛД, мг/кг веса) испытываемых соединейий определена на мышах при внутрибрюшин.ном введении в случае соединения А . и при внутривенном введении соединения Б.

Полученные результаты показаны в табл. 1..

Как видно из результатов, представленных в табл. 1, значение ост- .рой токсичности (ЛД ) предлагаемого соединения такого порядка, который позволяет применять его в качестве лечебного препарата.

Терапевтическое действие на нефротоксин, вызываюший нефрит.

Нефротоксин.крыс (для краткости НТ) получают следующим образом.

Кора надпочечника крысы равномерно смешивалась с равным количеством физиологического раствора. Гомогенизи-. рованную смесь .смешивали с полным стимулятором Фрейнда (продукт компании Difco) в.объемном отношении

1:1, 2,мл полученной смеси инъекциро вали внутримьппечно кролику (весом

3100 r) для иммунизации кролика. Че- рез полтора месяца брали кровь из сердца кролика и получали сыворотку.

Полученную .сыворотку инактивировали при. 56 С в течение 30 мин, затем выО саливали 40Х-ным насьпценным водным раствором сульфата амомния и фракционировали. Фракции /-глобулина (И/-Г) собирали.для получения НФ.

Оценку терапевтического действия проводили на самцах крыс линии Вистар с весом тела 150-160 г при трех повторениях для каждого испытываемого соединения . Испытываемое соединение

45. вводили внутрибрюшинно один раз в день в течение 7 дней. Через 1 ч после введения испытываемого соединения, на 3-й день вводили НТ (нефротоксин). НТ инъекцировали внутривенно в количестве 1. мл в вену хвоста каждой крысе. Физиологический раствор . соли использовали в контрольной группе.

Уровень протеинурии (общее количество выделившейся мочи .в течение

24-часового периода) измеряли методом белкового помутнения с использованием альбумина бычьей сыворотки, 1190989

Та блица 2

Показатели

До введения

Контроль

14

22

20

27

12

20 31

Среднее значение

20

33

Предлагаемое соединение

1,9

0,9

1,2

5,3

2,9

1,8

13 (3 мг/тело) 2,5

2,7

Среднее значение

3,2

2,3

1,3

9,7

40

50

55 как эталона, с помощью сульфосалициловой кислоты.

Номер дня отсчитывается со времени введения испытываемого соединения, которое происходит за час до введения нефротоксина, Уровень протеинурии у- здоровых крыс колеблется 0,5-5 мг/день. Если уровень протеинурии превышает эти пределы, особенно если уровень протеинурии выше 10 мг/день, то можно с уверенностью говорить о том, что имеет место нефрит. Как можно видеть из результатов. табл. 2, нефрит появился в контрольной группе, а в случае применения испытываемых предлагаемых соединений уровень протеинурии со времени введения нефротоксина до 10 дней после введения в значительной мере такой же, что и у здоровых крыс. Таким образом, введение предлагаемых соединений ингибирует первичные и вторичные иммунные реакции.

Терапевтическое действие при нефрите Хеймана.

В эксперименте использовали крыс линии Вистер самцов с весом

180-200 г. Экстрагировали кору надПолученные результаты представлены в табл. 2.

Уровень протеинурии, мг/день почечников крыс и гомогенизировали с равным количеством физиологического раствора по объему. Гомогенат центрифугировали при 1500 в течение 1 ч. Верхний слой жидкости очищали по известному методу и смешивали с полным стимулятором Фрейнда

37 Ra (выпускаемого компанией Difco) в отношении 0,4: 1 по объему..

Полученную смесь внутрибрюшинно инъецировали изологическим крысам в количестве 0,5 мг на крысу. 3атем такое же количество смеси вводили каждые две недели до тех пор, пока ротеинурия достигала уровня, превышающего 100 мг в день. Этот период составлял 6-8 недель.

Каждое из испытываемых соединений внутрибрюшинно вводили крысам, больным нефритом Хеймана (весом 300350 г) один раз в день в течение

7 дней и затем измеряли уровень протеинурии (мг/день) описанным способом. Физиологический раствор использовали для контроля. Полученные результаты представлены в табл. 3.

II90989

Таблица 3

Уровень протеинурии, мг/день

Показатели

21

135

126

114

132

127

135

103

121

105

121

109

105

135

1 32

109

121

117 .

137

Среднее значение

131

119

109

122

129

116

Предлагаемое соединение

27

117

127

13

129

119

123 . (3 мг/крысу)

Среднее значение

1 2 3

112

28

Редактор С. Патрушева

Заказ 7010/62 Тираж 353 Подписное

BHHHIlH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

До введения

Контроль

Составитель И. Федосеева

Техред М.Пароцай Корректор О.Луговая