Способ получения натриевых солей производных мурамилпептидов
Изобретение относится к производным пептидов, в частности к нагриевым солям -производных мурамилпептидов общей формулы 1. CHjOH 0х /NH-C(0)Ri С(0)-Шг R2;CH-C(0)-№i-chr3-C(0)-NH-CH-(cHi)j-C(0)-X где R, - С,-С,-алкил; ,. СН,, R, - С,-С4-алкил; А - Y-O-P(O)(ONa)- -0-CH2-chr4-CHгR5 при Y - 0-CH,j-C(0)- -NH-(CHj)j-, -NH-(CH2)2-NH-CH (СН,)- -C(0)-NH-(CH.t)2 -; К - Н; -О-С(О)- -(СН2),4 -СН,; Rj - -0-C (0)-(CH2)i4 - -СН,,которые обладают иммуностимулирующей активностью. Для выявления активности среды производных пептидов были получены новые соединения
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
09) Ш) ш 4 C 07 K 9/00 А61 К37/02
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К flATEHTY сн,ОН
CH20R ой8 е NH-сн- (сн,),-c(0)-!!(0) p(o)-DH
HC(O)R. С(0) ™Н2 О СН2-СНК,-СН2К5
Ц сн-(. (0)-К
К7О
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3350700/23-04 (22) 29. 10.81 (23) 24.07.80 (62) 2954161/23-04 (31) 6893/79 (32) 25.07.79 (33) СН (46) 15.12.86, Бюл. с)- 46. (7 1) Циба-Гейги АГ (СН) (72) Лайос Тарчай, Герхард Башанг, Альберт Хартманн (DE) и Ярослав
Станек (CS) (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Патент СССР Р 660589, кл . С 07 С 103/52, 30.04 .79. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТРИЕВЫХ СОЛЕЙ ПРОИЗВОДНЫХ ИУРАИИЛПЕПТИДОВ (57) Изобретение относится к производным пептидов, в частности к натгде R -R и Y имеют указанные значения 1 R e u R z каждыи В отдельности
Н или совместно — изопропилиден;
R)| — Н, бензил; К вЂ” ОН или -NH-СНКэ-С(О)ОХ при Х вЂ” Н или и-N0z1
CeCls -N C(0) CHz CHz C(0) условии, если К вЂ” ОН, то Е - группа
-NH-CHR -С(О)ОХ, и если К вЂ” NH-CHRq-С(О)ОХ, то Š— Н. Процесс вериевым солям -производных мурамилпептидов общей формулы 1.
Н ОН
-с(0®1 с(0) -NH<
Rg- CH — С(0}-МН- СНК -C(0)-NH-CH -(CHg) -С(О) -А где R — С,-С -алкил, К -Н,. СН, R — С, -С -алкил, А — Y-О-P (О) (0Na)—
-О-CHz -CHR.g-CHz К при Y — О-СН -Г (0)-NH-(СН,)., —, -NH-(СН,), -NH-CH (СН,)-С(0)-NH-(CH ) —; К вЂ” Н; -О-C(0)-(СН, ) „-СН, р R — -О-С(0) - (СН ), —
-СН ;которые обладают иммуностимулирующей активностью. Для выявления активности среды производных пептидов были получены новые соединения (1) Их синтез ведут конденсацией дут в среде инертного растворителя при температуре от 0 С до комнат,ной с последующим переводом полученного соединения в натриевую соль.
:При необходимости имеющиеся защитные группы отщепляют. Испытания (1) показывают, что они малотоксичны и проявляют иммуностимулирующую активность лучше, чем известный - N-бензоил-мурамил-L-аланил-D-изоглютамин.
1 табл.
fL) 5) О
И
А- -У-О-Р-О-CH -СН-СН -R
2
2 5
QNQ, Яц
-инсн, сн, вЂ, -NH-сн(сн, ) -соынсн сн, †; 25 (Х.) О
II
̈́— водород, p=p=(Cps ) С
2 У
Цель изобретения — получение новых производных мурамилпептидов, обладающих более высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низкой токсичностью. 40
Пример 1. Натриевая соль N-аце тил-мур амил-L-ал анил-D-изоглютаминил-L-аланин-2-(1, 2 -дипальмнто-! ! ил-Sn-глицеро-3 -фосфорил) -э тиламида (1) .
К 1,0 ммоль 1-!!!;бензил-N-ацетил-4,6-изопропилиден-мураминовой кислоты и 0,9 ммоль L-аланил-D-изоглю-! таминил-L-алания-2-(1, 2 -дипальми-! тоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил) -этилами- 50 да в смеси 15 мп диметилформамида, 10 мл тетрагидрофурана и 2 мл пиридина добавляют 1,2 ммоль дициклогексилкарбодиимида и 1,3 ммоль N -оксисукцинимида. Через 24 ч к реакционной смеси добавляют несколько капель воды, отфильтровывают осадок,цициклогексилмочевины, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток очищают с поИзобретение относится к способу получения новых биологически активных соединений, а именно натриевых солей производных мурамилпептидов общей формулы
0Н
cocoa
" Ы Г . .! где R — С; -С -алкил;
R — водород, СН,, R — С, -С -алкил; где У вЂ” -О-СНа-с0%СН,СН4-) В - — О-С вЂ” (СМ2)у -СН
II
1277906 2 мощью колоночной хроматографии на силикагеле (Мерк) с использованием в качестве элюента смеси хлороформ— метаноп (7:3). Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают, К остатку добавляют смесь 12 мл ледяной уксусной кислоты и 8 мл воды, выдержио вают 1.ч при 50 С, а затем гидрируют в течение 20 ч при комнатной температуре и атмосферном давлении в присутствии 107-ного палладия íà угле. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме, остаток растворяют в 150 мл воды, Полученный раствор фильтруют через тефлоновьЯ фильтрат типа "Миллипор" (5 мкм). Фильтрат подвергают диализу при перемешивании в ультрафильтраци» онной ячейке "Амикон" с использованием мембраны типа "Амикон YN 10" с применением диафильтрации против последовательно 400 мл воды, 200 мл . смеси 0,1 М натрийфосфатный буфер
0,1 M раствор NaCI (рН 7,0), 850 мл воды. Внутренний диализат фильтруют через тефлоновый фильтр типа "Миллипор" (0,45 мкм) ° Фильтрат сушат лио,фильно. В итоге получают 1,08 г (917) соединения 1,(g) =+13,9 (С 1,0, уксусная кислота), Наидено, Е: С э3,89; H 8,63, N 6,40," Р 2,22; Na 1,58. !
Вычислено, С 53,59; H 8,75, N 6 40; P 2,36, Na 1,75.
Пример 2. Натриевая соль N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-L-аланин-2-(1 2 -дипальмито-! ил-Sn-глицеро-3 -фосфорил) -этиламида (1) °
К раствору 1,0 ммоль D-изоглютаминил-L-алании-2-(1 2 -дипальмито/ ! ил-Sn-глицеро-3 -фосфорил) -этиламида и 3,5 ммоль N-этилморфолина в 25 мл смеси хлороформ — метанол — вода (65:25:4) добавляют по каплям
1,5 ммоль N-оксисукцинимидного эфира
N-ацетил-мурамил-L-аланина в 5, 0 мл диметилацетамида. Реакционную смесь перемешивают 8 ч при комнатной температуре, добавляют 130 мл воды и упаривают в вакууме для удаления хлороформа и части метанола. Оставшийся водный раствор фильтруют через тефлоновый фильтр типа "Миллипор" (5 мкм).
Фильтрат подвергают диализу при перемешивании в ультрафильтрационной ячейке "Амикон" с использованием мем3 1277906 браны типа "Амикон УМ 10" с примене — р нием диафильтрации последовательно н против 400 мл воды, 200 мл смеси л
О, 1 M натрийфосфатный буфер — 0,1 М раствор NaCI (рН 7,0) и 850 мл воды.
Внутренний диализат фильтруют через тефлоновый фильтр типа "Миллипор" (0,45 мкм). Фильтрат сушат лиофильно. д
В итоге получают 1,20 г (91/) соединения 1, R 0,29 (хлороформ — метанол — вода 6 :25:4) (А), 0,65 (хлороформ — метанол — уксусная кислота 1 вода 25: 15: 4: 2) (Б) . N
По всем остальным физико-химичес- а ким характеристикам полученный про- 15 ( дукт полностью соответствует соеди- О нению, полученному в примере 1.
Пример 3. Натриевая соль N
N — ацетил-мур амил-L-аланил — D-из оглю( таминил-L — аланин-2-(1 2 -дипальмиЭ тоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида (1) °
0,26 г (0,75 ммоль) N-ацетил-мурамил — L аланина 1,2 Н О и 0,172 г 25 (1, 5 ммоль) N-оксисукцинимида растворяют в 3,0 мл абсолютного диметилацетамида. К полученному раствору при 0 С добавляют 0,232 r (1,13 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакцион- 30 ную смесь перемешивают 8 ч при ООС и добавляют раствор 0,445 r (0,5 ммоль)
D-изоглютаминил-L-аланин-2-(1,2
I
-дипальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида и 0,07 мл (0,5 ммоль) триэтиламина в. 12 мл смеси хлоро форм — метанол — вода (65:25:4). Затем реакционную смесь перемешивают
24 ч при комнатной температуре, добавляют 60 мл этилацетата, перемеши- 40 вают несколько минут на ледяной бане и фильтруют. К фильтрату добавляют
65 мл воды и полученную смесь упаривают в вакууме для удаления легколетучих органических растворителей. Ос- 45 тавшийся водный раствор подвергают диализу при перемешивании в ультрафильтрационной ячейке типа "Амикон" с использованием мембраны типа "Амикон YM 10" последовательно против 50
200 мл воды, 100 мл смеси 0,1 М натрийфосфатный буфер — О, 1 М раствор
NaCI(pH 7,0) и 425 мл воды. Внутренний диализат фильтруют через тефлоновый фильтр типа "Миллипор" (0,45 мкм).55
Фильтрат сушат лиофильно. В итоге получают 0,546 г (837) соединения 1, R 0,45 (ацетонитрил — вода 3:1). По всем остальным физико-химическим хаактеристикам полученный продукт полостью соответствует соединению, поученному в примере 1.
Пример 4. Натриеная соль Nацетил-дезметилмурамил-L-аланил-Dизоглютамин-2-(1,? -дипальмитоил—
Sn-глицеро-3 -фосфорил) -этиламиа (II) .
Из 1,0 ммоль D — изоглютамин — 2— (1, 2 -дипальмитоил — Sn — глицеро-3 — фосфорил) — этиламида 2,8 Н О и ,5 ммоль N-оксисукцинимидного эфира;
-ацетил — дезметилмурамил-L-аланина налогично примеру 2 получают 1, 18 г
96X) соединения II, R(0,29 (А),,65 (Б) .
Найдено, X.: С 53,67; H 8,16, 5,93;. Р 2,40; Na 1,71.
С „Н,о, N,О, PNa 2,8 Н,О
Вычислено, X: С 53,88, Н 8,25, 5,71; Р 2,53, Na 1,88.
Пример 5. Натриевая соль
N-ацетил-мурамил — L-аланил-D — из оглютаминил- -окси-метилкарбонил-2-(1,2 —
-дипальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил) — этиламида (I/I).
Из 1 0 ммоль D-изоглютаминил- У
-окси-метилкарбонил-2-(1,2 -дипаль-! митоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида и 1,5 ммоль N-оксисукцинимидного эфира М-ацетил-мурамил-L-аланина аналогично примеру 2 получают 1,20 г (927) соединения III, R(0,28 (А), 0,68 (Б) .
Найдено, 7: С 53,21; Н 8,09;
N 5, 18, P 2,21; Na 1,58;
С5 Ню6 И О PNa ° 3,1 Н О
Вычислено, X: С 53 40 Н 8,13
N 5 37; P 2,38, Na 1,78.
Пример 6. Натриевая соль
N-ацетил-дезметилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин-2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил) -этиламида (Ig).
Из 1,0 ммоль D-изоглютамин — 2-(3
I пальмитоил-рац-глицеро-1 — фосфорил)— этиламида и 1, 5 ммоль N-оксисукцинимидного эфира N-ацетил-дезметимурамил-L-аланина аналогично примеру ,2 получают 0,69 г (69X) соединения
IV, Rg 0,47 (А) .
Найдено, 7: С 47,22; Н 7,17, N 7 31; P 3 01; Na 2,14, Вычислено, 7.: С 47, 08; Н 7, 24;
N 7,04, P 3,12; Na 2,31.
Пример 7. Натриевая соль
N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглю( таминил-L-алании-2-(3 -пальмитоил5 1277906
-рац-глицеро-1 -фосфорил)-этиламида (С) .
Из 1,0 ммоль D-изоглютаминил-1.—
-алании-2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил) -этилами77а и 1, 5 ммоль
N-оксисукцинимидного эфира М-ацетил-мурамил-L-аланина аналогично примеру 2 получают соединение V, R 0,22 (А) .
Найдено, .: С 47,71, Н 7,81, N 7,55; Р 2,71; Na 2,01,, Вычислено, .: С 47,92; Н 7,24
N 7,80; Р 2,88; Na 2,14.
Пример 8. Натр иевая соль
N-ацетил-дезметилмурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-L-алания-2-(1,2 (-дипальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил) -этиламида (VI) .
Из 1,0 ммоль D-изоглютаминил-L-алании-2-(1 2 -дипальмитоил-SnI
Э глицеро-3 -фосфорил) -этиламида и
1,5 ммоль N-оксисукцинимидного эфира
N-ацетил-дезметилмурамил-L-аланина аналогично примеру 2 получают 1,065 r (82X) соединения VI, Rg 0,39 (А).
Найдено, .: С 53,68; Н 8,02;
N P Na 1,60;
Вычислено, %: С 53,47, Н 8,14, N 6,45; Р 2,38; Na 1,77.
Пример 9. Натриевая соль
N-ацетил-дезметилмурамил-L-аланилI
-D-изоглютаминил-L-алании-2-(3 -паль1 митоил-рац-глицеро-1 — фосфорил) -этиламида (VII)
Из 1,0 ммоль N-изоглютаминил-Е-аланин-2-(3 — пальмитоил — рац-глицеI ро-1 -фосфорил) -этиламида и 1,5 ммоль
Н-нитрофенилового эфира N-ацетил-дезме(илмурамил-L-аланина аналогично примеру 2 получают соединение VII
Чт О, 16 (А), Выход О, 755 г (71 ) .
Найдено, X: С 47,48; Н 7,09;
М 7,80; P 2,71; Na 2,01;
C4zH7(,N(;О, PNa ° 2,8 Н О
Вычислено, X: С 47,66; К 7,19;
N 7,94," Р 2,93, Na ?, 17.
Пример 10. Натриевая соль
N-ацетил-мурамил-L-с ;аминобутирил(-D-изоглютаминил-L-алании-2-(1, 2
-дипальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфо-! рил) -этиламида (VIII) .
Из 1,0 ммоль D-изоглютаминил-?1
-алании-2-(1,2 -дипальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида, 1,5 ммоль N-ацетил-мурамил;1 -o4-аминомасляной кислоты, 2,5 ммоль дициклогексилкарбодиимида и 3,0 ммоль N1-оксисукцинимида аналогично примеру
3 получают соединение VIII, Ry 0,32 (А) .
Найдено, .: С 53,74, Н 8,23;
N 6,04; Р 2,18, Na. 1,54, Вычислено, .: С 53,56, Н 8,18, N 6 25; Р 2,31", Na 1 71.
Пример 11. Натриевая соль
N-пропионил-нормурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-L-аланин-2-(1,2 -ди( пальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил)(-этиламида ((.Х) .
Из 1,0 ммоль D-изоглютаминил-LI
-алании-2-(1 „2 -дипальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил) -этиламида м 1, 5 ммоль
N-оксифталимидного эфира N-пропионил-нормурамил-L-аланина аналогично примеру 2 получают 1,15 r (87X) соединения 1Х, R О, 16 (A),Го )в=+5 (С 0,547, уксусная кислота) .
Найдено, : С 53,31, Н 8,26;
N 6,14; Р 2,15, Na 1,55.
С 9Н юв ИБО„РИа 3,5 Н О
Вычислено, Е: С 53,53, Н 8, 17, N 6 35; Р 2,34, Na 1,74.
Пример 12. Натриевая соль
N-ацетил -мур амил-L -ал анил-S-и з оглютамин-2-(1, 2 -дипальмитоил-Sn-гли(I церо-3 -фосфорил) -этил амида (Х) . ((Из 1,4 ммоль D-изоглютамин-2-(1, z-дипальмитоил-Sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида и 2,0 ммоль N-оксисукцинимидного эфира N-а етил-мурамил-L-аланина аналогично примеру 2 полу-.
35 чают 1,52 r (88 ) соединения Х, R
0,31 (А), 0,64 (Б) °
Найдено, : С 5 -,63, Н 8,25, N 5,87; Р 2,40; Na 1,59, 40 Вычислено(% С 54р49» Н 8у35
N 5 68; Р 2,51, Na 1,86.
Иммуностимулирующая активность сое-. динений Х-Й была изучена в опытах in
45 vivo по способности увеличивать об» разование антител у мышей. Исследования проводились в сравнении с известным иммуностимулятором — N-бензоил-мурамил-I. — àëàíèë-D-изоглютамином, который является структурным аналогом соединений 1-Х. Мьш(ей породы NMRI иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 10 мг bCA. Через 9, 15 и 29 дней отобрали пробы сыворотки крови и исследовали их на содержание антител к БСА с помощью метода пассивной гемагглютинации. В использованной дозе (10 мг/кг) БСА для животных-реципиентов субиммуно1277906 генен, т.е. не вызывает выработки антител или их образование является незначительным, Дополнительное введение иммуностимулирующих соединений перед или после введения антигена приводит к увеличению титра антител в сыворотке. Иммуностимулирующий эф- фект изучаемых соединений оценивали с помощью суммы разностей титров fog во всех трех пробах. Для соедине- 10
Ф ний j-X u N-бензоил-мурамил-L-аланилМ
-D-vsorxrro arm a (X1) определили дозу, при введении которой животным сумма разностей титров 1од составляет 10.
Острая токсичность соединений f-X бы- 15 ла определена на мышах. Иммуностимулирующая активность и острая токсичность натриевых солей производных мурамилпептидов I-Х приведены в таблице.
20 (Ll П11
II ,— -".",-о-с-(сн,)„-снз, 25
Bg — — 0 — С-(СН 11g- СН3
2260
0,1
3050
5,0
30 отличающийся тем, что, соединение общей формулы
2150
0,6
2110
2,0
СН ОВ6
2960
0,9
35
-OPS
R7
NHCOB( ц;сн
COL
2780
5 0
VII
2310
0,8
VIII
40
3020
2,5 гдек,ик
R6HR
2440
3,0
140
45
S
-НН-СН(К )-СООХ, (Ь) О
- MQ
О.
Соединение Доза, мг/кг ЛД, мг/кг
Как видно из таблицы, соединения
I-X обладают высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низкой токсичностью и по активности значительно превосходят известный иммуностимулятор — N-бензоил-мурамил-Ь-аланил-D-изоглютамин (Х1).
Формула из обретения
Способ получения натриевых солей производных мурамилпептидов общей формулы
ОН янсон»
R—
2 з
СОЮЦ сн-сони-Ьм и снгсоА где Rt — С -С -алкил, Rz — водород» СНу»
Rs — С,-С4 алкил, О
l1
А- -y-î-р-о-сн,- сн-си -я
l I
ONa Яц где Y — -О-СН -CONHCH СН
z т а
-ИНСН СН, -Ин-СН(СН )-C0NHCH СН вЂ” ; (Ь) имеют указанные значения, каждый в отдельности водород или совместно изопропилиден, водород, бензил;
ОН или остаток формулы где R имеет указанные значения;
Х вЂ” водород, и -нитрофенил, пентахлорфенил, 1277906 10
-NH-CH(R )-COз (L) где R имеет указанные значения при условии, что Š— -NH-CH(R )-COOX, 5 (1) если L — ОН и Š— водород, если L — -NH-СН(К ) -СООХ, COH< 1
Е-Ын-СН-СИ Си СО-Т О-Р-о-снг + сн2- 4 т
O) hH ив (L.) ч где У, R< и R имеют указанные значения
Š— водород или остаток формулы
Составитель О.Галкин
Редактор И.Рыбченко Техред В.Кадаp Корректор М.Максимишинец
Заказ 6767/61 Тираж 343 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35., Раушская .наб., д. 4(5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 конденсируют в инертном органическом растворителе или смеси растворителей при температуре от 0 С до комнатной температуры с соединением общей формулы отщепляют в случае необходимости имеющиеся защитные группы и полученное соединение переводят в его натриевую соль.
