Способ определения содержания растворимого фибрина в плазме крови
Изобретение может быть использована при диагностике заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза . Цель изобретения - повьшение точности и чувствительности способа. К цитратной плазме прибавляют раствор протаминсульфата на фосфатном буфере . Смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют. Осадок растворяют в уксусной кислоте, спектрофотометрируют и определяют содержание растворимого фибрина в плазме крови. Для осаждения используют отечественный препарат. 1 табл. со ел 4
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (19) (Ш (51)4 С 01 N 33 50 аС:Я Г1З
I!. 1,., ((Я
p),(Г
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ . СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3870761/28-14 (22) 22 ° 03.85 (46) 23.11.87. Бюл. 1(43 (71) Институт биохимии им. А.В.Палладина и Киевский медицинский институт им. А.А.Богомольца (72) В.А.Белицер, T.В.Варецкая, Л.И.Михаловская, ЯЯ.Ена и Л.А.Дидковская (53) 616.07(088.8) (56) Патент США М 4210420, кл. G 01 N 33/16, 1980. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ
РАСТВОРИМОГО ФИБРИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение может быть использовано при диагностике заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза. Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа.
К цитратной плазме прибавляют раствор протаминсульфата на фосфатном буфере. Смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют. Осадок растворяют в уксусной кислоте, спектрофотометрируют и определяют содержание растворимого фибрина в плазме крови. Для осаждения используют отечественный препарат. 1 табл. ьЕ Ч 1000
С (мг ) = —.
У" Ч
1 135411
Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-лабораторной диагностике, и может быть использовано при диагностике заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза.
Целью изобретения является повышение точности и чувствительности способа за счет изменения концентрации раствора протаминсульфата, добавляемого к плазме крови, и введения поправочного коэффициента при расчете количества растворимого фибрина.
Способ осуществляют слецующим образом, 15
К аликвоте свежевзятой бестромбоцитарной цитратной плазмы прибавляют равный объем раствора протаминсульфата (на фосфатном буфере) до конечной концентрации последнего 0,4-0,6 .
Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 25 С, Осадок отделяют центрифугированием, дважды промывают физиологическим раствором и растворяют в 1,5-5 -ной уксусной кислоте, 25 раствор спектрофотометрируют при длине волны 280 мм с поправкой на мутность при 320 нм.
Расчет растворимого фибрина проводят по формуле, исходя из соотношения 30 фибрина к осадку 1:(2,8-3,0).
Пример 1. В коническую пробирку объемом 10-12 мл вносят 0,5 мл патологической плазмы термостатируют 35 о
Р
2-3 мин при 25 С и прибавляют равный объем 1%-ного раствора протаминсульфата в 0,06 М фосфатного буфера, рН
7,4, р =0,15, t=25 С. Конечная концентрация протаминсульфата равна 40
0,5 . Смесь тщательно перемешивают и выдерживают 30 мин при 25 С, после чего осадок отделяют центрифугированием при 2,5 тыс. об/мин в течение
15 мин и дважды промывают физиологи- 45 ческим раствором с последующим центрифугированием. После последнего центрифугирования пробирки переворачивают вверх дном на фильтровальную бумагу и дают стечь несколько минут. 50
Полученный осадок растворяют в 3 мл
1,5 -ной уксусной кислоты и получен= ный раствор спектрофотометрируют при длине волны 280 НМ с поправкой на мутность при 320 нм. Количество фибрина рассчитывают по формуле
5 2 где К=2,86, что учитывает отношение экстинкции белка в осадке к экстинкции фибрина;
V — - объем взятой в тест плазмъц
V — объем спектрофотометрированного
1 раствора; ьЕ
Eàåî
-E разница экстинкций раствора при длинах волн 280 и 320 нм;
2 = коэффициент экстинкции фибриногена в кислой среде равен 15,00. при V=0,5; V =3,0 и LE=0, 120
С =16,8 мг ..
Пример 2. Определение и расчет проводят как в примере 1, но для осаждения к плазме прибавляют 0,5 мл
0 8 -ного раствора протаминсульфата (конечная концентрация протаминсульфата равна 0,4 ), а осадок растворяют в 3 мл 3,0%-ной уксусной кислоты
С Е Ч 1000
142
Пример 3. Определение и расчет проводят как в примере 1, но для осаждения прибавляют 0 5 мо 1,2 . протаминсульфата (конечная концентрация равна 0,6 ), а осадок растворяют в
3 мл 5%-ной уксусной кислоты.
6E V 1000
С = — -- — — -= Е ° 133 33=17 4 Mr .
Ч 3,04
Пример 4. В этом примере проводят сравнительное определение количестна растворимого фибрина в модельных смесях предлагаемым и известным спосбоами. Моделью служит донорская плазма с внесенным известным количеством фибрина. Известный способ воспроизводят с применением препарата протаминсульфата фирмы Sigma".
В предлагаемом способе для осаждения применяют отечественный препарат Õaбаровского фармакологического завода.
Данные, полученные обоими способами, приведены в таблице.
Как видно из таблицы, известный способ обладает слабой чувствительностью. В пробах же с высоким содержанием растворимого фибрина результаты, полученные этим способом, значительно превьппают внесенное количество фибрина, Это объясняется тем, что в осадке, наряду с фибрином, обнаруживается значительное количество фибриногена, что подтверждают экспе13541
Внесенное количество фибрина, мкг/мл
Известный способ редлагаемый способ
Количество Ошибка, оличество Ошибка, ибрина, Ж кг/мл фибрина, 7 мкг/мл
200
1 272
0,6 195
198
150
151
100
4,0
10
104
100
10,0
100
12,0
28
Составитель В. Гудошников
Редактор А.Ворович Техред Л.Олийнык Корректор С.Черни
Заказ 5688/40 Тираж 776 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, t .Ужгород, ул.Проект а ктная 4 риментальные данные, полученные с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия восстановленных дитиотриэтолом протаминсульфат5 ных осадков.
Формула изобретения
Способ определения содержания растворимого фибрина в плазме крови, включающий осаждение протаминсульфатом, промывку комплекса фибриногенфибрин с последующим растворением
4 его и спектрофотометрическим анализом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, осаждение проводят при соотношении объемов плазмы к протаминсульфату 1:1 до конечной концентрации последнего 0,4-0,67., дважды промытый комплекс растворяют в 1,5-5Х-ном растворе уксусной кислоты и после фотометрирования количество растворимого фибрина определяют из соотношения фибрина к осадку 1:
:(2,8-3,0).
