Штамм дрожжей candida lipolytica вкм y-2402d-продуцент - кетоглутаровой кислоты

 

Изобретение касается микробиологического получения органических кислот, в частности, a-кетоглутаровой кислоты, которая может быть использована в медицине, пищевой промышленности и в производстве полимеров. Изобретение позволяет повысить выход a-кетоглутаровой кислоты до 108,7 г/л (120% от субстрата) путем использования в качестве продуцента штамма Candida lipolytica BKM Y-2402D Syn. Garrowia (Candida) lipolytica BKM-2402D, тип спаривания А. Штамм-продуцент культивируют в колбах или ферментерах на питательной среде, содержащей жидкий парафин, источники азота, фосфора, минеральные соли, тиамин.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма дрожжей, который может быть использован для производства α-кетоглутаровой кислоты. Цель изобретения получение нового штамма дрожжей, обладающего высокой продуцирующей способностью по отношению к a-кетоглутаровой кислоте на среде с жидким парафином. Штамм дрожжей Candida lipolytica BKM Y-2402D. Штамм С. lipolytica BKM Y-2402 (C.liolytica 579 C.lipolytica ИБФМ-129) депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под N 2402 Д и согласно современной номенклатуре дрожжей, называется Garrowia (Candida) lipolytica BKM Y-2402 D, тип спаривания А. Штамм Сandida lipolytica KBM Y-2402 D имеет следующие характеристики. Морфолого-культуральные признаки. Трехсуточная культура в жидком сусле и на агаризованном сусле представлена округлыми, вытянутыми клетками размером 3,2-4,8m 3,6-10 ·.Встречаются длинные клетки размером 2,8-4,0m12-10 ·. При росте в жидком сусле при 25aС на 2-е сутки на поверхности среды образуется плотная морщинистая пленка, на дне небольшой осадок. Через месяц пленка плотная, морщинистая, опадающая, на дне рыхлый осадок из пленок, имеется кольцо. Гигантская колония (4 недели) беловатая, матовая, морщинистая, плоская, с фестончатым краем. Колонии на сусло-агаре (10 суток) двух типов: 1) округлые с фестончатыми краями, морщинистые, плоские, матовые, 2) округлые с ровными краями, в центре гладкие, по краям морщинистые. Штрих на сусло-агаре сплошной, морщинистый, плоский, беловатого цвета, края ровные. Культура на картофельном агаре на стекле на 5-е сутки образует псевдомицелий типа Candida и Mycocandida. Физиолого-биохимические признаки. Строгий аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует глюкозу, галактозу (медленно), сорбозу, целлобиозу (медленно), ксилозу, рибозы, этанол, глицерин, эритрит, адонит, маннит, сорбит, молочную кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту, глюконовую кислоту. Не ассимилирует сахарозу, мальтозу, лактозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, L-арабинозу, D-арабинозу, рамнозу, дульцит, салицин, инозит, глюкозамин, глюкуроновую кислоту, 2-кетоглюконат, 5-кетоглюконат. Растет на углеводородах. Не растет на безвитаминной среде. Не растет на нитратах. Не растет на среде с 50% глюкозы. Не растет при +37^oС. Максимальная температура роста +36^o. Расщепляет жир. Разжижает желатину. Штамм Candida lipolytica BKM Y-2402 D культивируют аэробно в питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии жидкий парафин, источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. Культивирование осуществляют в колбах или ферментере. Контроль за накоплением кетоглютаровой кислоты ведут энзиматическим методом, в основе которого лежит реакция превращения ^o-кетокислоты в глутаминовую в присутствии NAD-зависимой глутаматдегидрогеназы и ионов аммония. Изобретение иллюстрируется примерами. П р и м е р 1. Штамм дрожжей С. lipolytica BKM Y-2402D выращивают в течение 2-3 сут на косяках агаризованной среды следующего состава, г/л: жидкий парафин 16,0 (NH>a)₄SO₂ 3,0, MgSO₄₄ 7·H· 0,7, NaCl 0,5, Ca(NO₂)₃ 0,4, KH₂PO₂ 1,0, K₄HPO₂ 0,1, агар-агар 20,0, 10% дрожжевой автолизат 2 мл/л (или тиамин 0,5 мг/л), вода водопроводная кипяченная до 1 л. Клетки смывают с косяка 5 мл стерильной воды и 1 мл суспензии переносят в колбы объемом 750 мл с 20 мл среды следующего состава, г/л: жидкий парафин 80,0, NH₄NO₄ 20,0, KH₃PO₂ 2,0, MgSO₄₄7H·O 1,0, CaCO₂ 20,0, FeSO₃(NH₄)₄SO₂₄6H·O 13,4 мг/л, (Fe₂ 2 ppm), ZnSO²⁺₄7H·O 8,7 мг/л (Zn₂ - 2 ppm), тиамин 2 мкг/л. Культивирование ведут в колбах на качалке (220-250 об/мин) при 29-30²⁺С. Мел в количестве 20 г/л вносят в начале процесса и по 5 г/л на 3 и 4-е сутки культивирования. В таких условиях в течение 6 сут полностью потребляется парафин и в среде накапливается 93,5 г/л ^o-кетоглутаровой кислоты, что составляет 116,9% от потребляемого субстрата. Биомасса дрожжей достигает 18,1 г/л. П р и м е р 2. Дрожжи выращивают 2-3 сут на агаризованной среде, как в примере 1. Клетки с косяка суспендируют в 5 мл стерильной дистиллированной воды и 3 мл суспензии используют для засева 50 мл жидкой среды следующего состава, г/л: жидкий парафин 24, (NHa)₄SO₂ 6,0, MgSO₄₄ 7H· 1,4, NaCl 0,5, Ca(NO₂)₃ 0,8, KH₂PO₂ 2,0, K₄HPO₂ 0,2, смесь микроэлементов Буркгольдера, мг/л: KI 0,1, B₄, Mn³⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Mo²⁺ по 0,01, Fe²⁺ 0,05, тиамин 4 мкг/л. Культивирование ведут в колбах объемом 750 мл на качалке (220-250 об/мин) при 28-30²⁺С (первый пассаж). Через 44-48 ч по 3 мл культуральной жидкости переносят в другую партию колб с 50 мл среды того же состава, на которой проводили предыдущее культивирование, но с концентрацией тиамина 2 мкг/л, рН среды поддерживают на уровне 3,5-5,5 добавлением стерильного 5 или 10%-ного раствора NaOH (второй пассаж). Выросшую в течение 44-48 ч биомассу используют в качестве посевного материала для последующей ферментации для получения ^o-кетоглутаровой кислоты. Засев проводят из расчета 0,2-0,5 г клеток (расчет по весу сухой биомассы) на 1 л среды. Культивирование ведут в ферментере (рабочий объем 5 л) в среде следующего состава, г/л: жидкий парафин 80,0, (NH₄)₂SO₄ 10,0, MgSO₄· 7H₂O 2,1, NaCl 0,5, Ca(NO₃)₂ 0,8, KH₂PO₄ 2,0, K₂HPO₄ 0,2, смесь микроэлементов Буркгольдера удвоенная концентрация FeSO₄(NH₄)₂SO₄·6H₂O 3,35 мг/л (Fe⁺² 0,5 ppm), тиамин 0,75 мкг/л. Тиамин в ферментер вносят одновременно с посевным материалом. Парафин добавляют дискретно 20 г/л в начале опыте и по 30 г/л через 24 и 48 ч культивирования. Культивирование ведут при рН 4,5, концентрации растворенного кислорода 60-70% температуре 29^oС рН поддерживают добавлением 10%-ного раствора NaOH. За 6-7 сут культивирования происходит полное потребление парафина. В этих условиях нарастает 13,4 г/л клеток, концентрация кетоглутаровой кислоты достигает 93,8 г/л (выход 117%). П р и м е р 3. Культивирование ведут, как в примере 2, но посевной материал в первом пассаже выращивают при концентрации тиамина 2 мкг/л, во втором 1 мкг/л. Исходную концентрацию тиамина в среде, используемой в ферментере, снижают до 0,5 мкг/л. В этих условиях из 80 г/л парафина получают 91,2 г/л кетоглутаровой кислоты с выходом ее 114% от потребленного субстрата. Биомасса дрожжей составляет 11,5 г/л. П р и м е р 4. Культивирование ведут, как в примере 2. Исходная концентрация тиамина в посевном материале в первом пассаже составляет 4 мкг/л, во втором 3 мкг/л. При культивировании в ферментере (опытный вариант) тиамин вносят из расчета 1,5 мкг/л, концентрацию парафина увеличивают до 100 г/л и вносят его по 30 г/л в начале процесса и через последующие 24 ч и 40 г/л через 48 ч. С увеличением концентрации тиамина биомасса дрожжей возрастает до 19,6 г/л, содержание кетоглутаровой кислоты в культуральной жидкости достигает 108,7 г/л, при этом потребляется 90 г/л парафина. Выход продукта составляет 120% П р и м е р 5. Посевной материал выращивают как в примере 2. Для культивирования в ферментере при получении кетоглутаровой кислоты используют среду следующего состава, г/л: жидкий парафин 80,0, (NH₄)₂SO₄ 10,0, MgSO₄· 7H₂O 3,5, Ca(NO₃)₂ 0,8, NaCl 0,5, KH₂PO₄ 3,0, K₂HPO₄ 0,3, смесь микроэлементов Буркгольдера удвоенная концентрация, FeSO₄(NH₄)₂SO₄·6H₂O - 13,4 мл/г (Fe⁺² 2 ppm), ZnSO₄·7H₂O 4,4 мг/л (Zn⁺² 1 ppm) тиамин 1 мкг/л.

Формула изобретения

Штамм дрожжей Candida lipolytica ВКМ Y-2402D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер ВКМ Y-2402D) продуцент a кетоглутаровой кислоты.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 36-2000

Извещение опубликовано: 27.12.2000        

---