Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк per-33, кодирующей зрелый @ -интерферон человека

 

Изобретение относится к области генетической инжекции, в частности к способу получения плазмиды, пригодной для получения интерферона типа о. Предлагаемый способ получения рекомй, бинантной плазмиды заключается в том, что в плазмиду pER 103 вводят промотор-операторный RBS-фрагмент, после обработки Hind HI эндонуклеазой и фосфатазой данную плазмидную ДНК через линкерную последовательность легируют с 1РЫ-о -последов 1тельностью, причем в полученную таким образом плазмиду через EcoRI-Bam HI линкер вводят par-Lokus, выделенный EcoRI эндонуклеазой из плазмиды рРМ 31, или же ДНК фрагмент длиной л/130 Ьр, полученный путем обработки плазмиды pER 33 ферментами EcoRI и Ват HI. I СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3935004/28-13 (62) 3681952/28-13 (22) 02.08.85 (23) 23.12.83 (31) Р 32479220 (32) 24.12.82 (33) DE (46) 15.08.88. Бюл. й- 30 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (DE) (72) Марк-Брусс Дворкин (ПБ), Эва

Дворкин-Растль, Гюнтер Адольф (AT), Норберт Гауель (DE) Петер Мейндль, Петер Светлы и Рудольф Хауптманн (AT) (53) 575.224.2; 577.2 (048)(088.8) (56) Goeddel Р.Ч. et.al. Human leukocyte interfегоn produced by E.coli

is biologically active. Nature, 1930, 287, р. 411-416. (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ PEKOYSHНАНТНОЙ ПЛАЗИЩНО 1 ДНК pER-33, КОДИ(594 С 12 М 15/00 А 61 К 45 02

РУБЦЕЙ ЗРЕЛЬЙ a(-ИНТЕРФЕРОН ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к области генетической инжекции, в частности к способу получения плазмиды, пригодной для получения интерферона типа î(.

Предлагаемый способ получения реком бинантной плазмиды заключается в том, что в плаэмиду pER 103 вводят промотор-операторный RBS-фрагмент, после обработки Hind III эндонуклеазой и фосфатаэой данную плазмидную ДНК через линкерную последовательность легируют с IFN-*последовательностью, причем в полученную таким образом плазмиду через EcoRI-Ваш HI линкер вводят par-Lokus, выделенный EcoRI эндонуклеазой из плаэмиды рРМ 31, или же ДНК фрагмент длиной 130 bp, полученный путем обработки плаэмиды рЕК

33 ферментами EcoRI u Bam HI.

1417800

5 AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGССТТС

3 GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG (к- Promotor.

GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTÒÒÀ

CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA — ;;...,.I...,..., в результате реакции лигирования после его обработки Hind III и фосфатазой сшивают с линкерной последовательностью формулы

)а Linker — — -Ч

AGCTTAAAGATGTGT 20

ATTTCTACACACTAG

М-- ---) FN-4-Gen к которой присоединяют кодирующую IENH-последовательность причем дополни1

25 тельно в полученную таким образом плазмиду через Есо Ri-BamHI-линкер вводят par-Еokus, выделенный Есо RI эндонуклеазой из плазмиды рРМ 31, или же ДНК-фрагмент длиной примерно

1300 Ьр, полученный путем обработки 30 плазмиды рЕКЗЗ ферментами Есо RI и Bam HI.

Конечную плазмиду трансформируют в Escherichia coli НВ 10 1, и отбирают

1) NTI - О

ОС2Н5

Π— SI — — (СН2) — 14- СО-(СН2)2 — СО-О

l l

OC2H5 Н

ТГФ. Через 10 мин реакционный раствор нагревают до комнатной температуры и центрифугируют. Надссадочную жидкость переносят с помощью пипетки в сухую заполненную аргоном колбу со шлифом (25 мл) . При комнатной температуре растворитель отсасывают в ва.кууме, затем добавляют по 0,5 мл толуола и ТГФ и снова выпаривают, причем в качестве продукта остается бесцветное вспененное твердое вещество. Этот продукт не анализируют на его чистоту, а растворяют в 10,0мл абсолютного пиридина и этот раствор хранят под аргоном при -20 С вплоть

Изобретение относится к генетической инжс верин, в частности к способу получения плазмиды, пригодной для получения интерферона типа o(.

Предлагаемый способ получения плазмиды, кодирующей зрелый n(-интерферон

Удельная нагрузка составляет 6845

104 мкмоль нуклеозида на 1 г материала-носителя.

Пример 2. 5 -Диметокситритилдезокситимидин-3 -хлорметоксифосфит.

Полностью защищенные нуклеозид-3 хлорметоксифосфиты синтезируют по известным способам, 544, 6 мг (1, 0 ммоль)

5 -диметокситритил-тимидина (DMTrТЙ) растворяют в 1,0 мл абсолютного ТГФ и этот раствор при -78 С в течение

15 мин в атмосфере аргона прикапывают55 к перемешиваемому раствору 0,9 мкмоль метилдихлорфосфита в 0,5 мл абсолютного пиридина и 2,0 мл абсолютного

2 человека, заключается в том, что плазмиду pER 103, .которую получают путем расщепления рВКЗ?2 эндонуклеаэами с последующим удалением Есо Rl-Hind

III-фрагмента длиной 29 Ьр и введением ДНК-последовательности формулы нужные клоны, трансформированные плаэмидой и культивируют их известными методами.

Изображение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1 ° Функционализацию полимерного материала-носителя осуществляют по известным способам. В ка 4честве материала-носителя служит HPLCсиликагель (Macherey 5Nagel), уазмер зерен 20 мкм, размер пор 200 А). Его дериватизируют методом Mateucci u

Caruthers, за исключением того, что стадию сукцинирования осуществляют с помощью ангидрида янтарной кислоты в безводном пиридине. Защищенные нуклеозиды таким образом связывают ковалентно с силикагелем соответстенно следующей формуле

1 3 !41780, до дальнейшего применения (максимально в течение одной недели).

Пример 3. 5 -ДиметокситритилI

N"- -изобутирил-дезоксигуанозин-3 -хлорметоксифосфит.

Аналогично примеру 2 получают -раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10,0 мл пиридина из 640,0 мг (1, 0 ммоль:

5 -диметокситритил-N2-изобутил-дезок0 сигуаноэина.. яагрузка (мкмоль/г) =

Пример 4. 5 -ДиметокситритилN-бензоил-дезоксицитидин-3 -хлорметок- .

СифОСфит.

Аналогично примеру 2 получают раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10.,0 мл пиридина из 683,7 мг (1,0 ммоль) 5 -диметокситритил-N бензоил-.дезоксицитидина.

Пример 5. 5 -ДиметокситритилN -бензоил-дезоксиаденозин-3 -хлор6 I метоксифосфит.

Аналогично примеру 2 получают раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита 25 в 10,0 мл пиридина из 657,7 мг (1,0 ммоль) 5 -диметокситритил-N— бензоил-дезоксиаденозина.

Пример 6. Синтез d-ТССТТА.

50 мг (5 мкмоль) содержащего

DMTrdA полимерного носителя (см. пример 1) вносят в стеклянную фритту.

Соответственно .следующему шагу затем добавляют различные растворители и растворы реактивов; носитель в ней кратковременно встряхивают и раствор после желательного взаимодействия снова удаляют тем, что с помощью тока аргона его вытесняют вверх через фритту. а) Отщепляют DMTr-группы с помощью

3 мл раствора из 70 r бромида цинка, -,500 мл нитрометана и 5 мл воды, время реакции 10 мин; б) осуществляют 4 промывки по 3 мл

0

4 смесью и-бутанол-дутидин-ТГФ (4: 1: 5); н) осуществляют 4 промывки по 4 мл абсолютным пиридином; . г) неконденсирование ближайшей нуклеотидной единицы: 1 мл пиридиновоI го раствора 5 -диметокситритил-дезокситимидин-3 -хлорметоксифосфита (пример 5) (примерно 100 мкмоль) под аргоном добавляют. в фритту к полимерному носителю и его встряхивают в растворе, время реакцйи составляет 10 мин; д) осуществляют 3 промывки по 3 мл абсолютным пиридином; е) осуществляют окисление сложным три эфирОМ Aocd)opHcTOH кислоты с .по мощью 100 мг.иода, растворенного н

3 мл смеси из ТГФ, лугидина и воды (2:2:1), время реакции 7 мин; ж) осуществляют 3 промывки по 4 мл

ТГФ; з) ацетилируют непревращенные 5—

ОН-группы с помощью раствора 150 мг

4-диметиламинопиридина, 0,3 мл коллидина, О, 25 мл ацетангидрида и 2,5 мл

ТГФ, время реакции 5 мин; и) осуществляют 4 промывки по 3 мл нитрометаном.

Цикл от а) до и) повторяют теперь четыре раза, причем на стадии r) используется необходимый для последовательности нуклеотидный структурный элемент.

После приконденсирования последнего нуклеотидного структурного элемента материал носителя высушивают в вакууме масляного насоса, пробу взвешивают с точностью до 1 мг и смешивают с 10,0 мл О, 1 M раствора толуолсульфокислоты в ацетонитриле. Путем происходящего при этом отщеплении диметокситритил-катиона получают оранжево-красный окрашенный раствор, абсорбция которого измеряется при

498 нм. По формуле

498

) (фактор разбавления) 14 3 вес носителя (мг) можно рассчитать загрузку материаланосителя диметокситритильными защит.ными группами. Получают 43 мкмоль/г.

Это соответствует среднему выходу 857 на. стадию конденсации.

Отщепление метильных остатков от триэфирных групп фосфорной кислоты.

Материал носителя в течение 45 мин встряхивают в 4 мп раствора тиофено" ла, триэтиламина и диоксана (1:1:2), I затем промывают метанолом, после это50 го эфиром. .Материал носителя в течение 14 ч нагревают с 1О мл концентрированного аммиака при 50 С, водный раствор затем отсасывают и фильтрат концентрируют в вакууме примерно до 2 мл.

Полученный сырой продукт, содержащий на 51-конце диметокситритильную группу, подвергается воздействию об7800

НРЬC †диаграм продукта: колонна

300 х 7,8 мм, ц-Bondapak С фирмы

Waters; элюант 0,1 Г1 триэтиламмонийацетатный буфер, рН 7 с 2б ацетонитрила; истечение,1,5 мл/мин; время удерживания 5,2 мин.

Пример 11. Синтез d-TGTGATCTGCCTCA.

Получают аналогично примеру 6 uc6z ходя из 250 мг (22 мкмоль) DMTrdA -Р.

НРЬС-диаграмма продукта: колонна

300 х 7,8 мм, (и-Bondapak С фирмы

Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатныи буфер, рН 7 с 25Х ацетонит15 рила; истечение 1,5 мл/мин; время удерживания 6,1 мин.

Пример 12, Синтез d-CAGATCACA.

Получают аналогично примеру 6 исхо, дя из 150 мг (13,2 мкмоль) DMTrdA -P.

Ь2

Zp НРЬС-диаграмма продукта: колонна

300 х 7,8 MM,p Bondapak С фирмы

Waters; элюант 0,1 И триэтиламмоний-. ацетатный буфер с рН 7 с 20Х ацетонитрила; истечение 0,2 мл/мин; время

25 удерживания 5,2 мин.

Анализ последовательностей синтетически полученных олигодеоксинуклеотидов осуществляют после того, как они встроены в интерферонпродуцирую-., Зп щую плазмиду pER 33.. С,помощью этого анализа одновременно подтверждают правильность последовательности оснований в олигооксинуклеотидах.

Пример 13. Плазмида рВР 101, 35 которая содержит примерно фрагмент размером 1000 Ьр, кодирующий триптофановый оперон Serratia marcescens, представляет собой исходный материал для выделения промотор-операторной области. Эта регуляторная область находится внутри.Eco RI-Hae III-фрагмента длиной 90 Ьр, в котором промо тор ориентирован в направлении Есо

RI Hae

Получают аналогично примеру .6 ис, ходя из 300 мг (30 мкмоль) РМТгс1А -P.

62

HPLC-диаграмма продукта: колонна

300 х 3,9 мм, p-Bondapak С фирмы

Waters; элюант О, 1 M триэтйламмонийацетатный буфер с рН 7 с .12 ацето,нитрила; истечение 1,5 мл/мин, время удерживания 4,4 мин.

Пример 8. Синтез d-АССТТАААСС., Получают аналогично примеру б исходя из 200 мг (16 мкмоль) РМТгйС -P.

HPLC-диаграмма продукта: колонна

300 х 3,9 мм, р -Bondapak С(фирмы

Waters; элюант О, 1 M триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7 с 12Х ацетонитрила; истечение i 5 мл/мин, время удерживания .3,4 мин.

Пример 9. Синтез d-CATCTTTA.

Э

Получают аналогично примеру 6 исходя из 150 мг (1,32 мкмоль)

РМТ,С1АЬ

HPLC-диаграмма продукта: колонна

300 х 7,8 мм, p-Bondapak С< фирмы

Waters; элюант: 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН ? с 20 . ацето †нитрила; истечение 1,5 мл/мин; время удерживания 7,7 мин, 5 141

° ратимой фазы НР1С. Колонна p-Bondapak С Фирмы Waters элюант: О, 1 М триэтиламмонийацетатный буфер с pFI 7 с 25Х ацетонитрила; истечение 2 мл/

/мин; время удержания 14 мин. Собранные фракции после элюирования концентрируют примерно до объема 1 мл, смешивают с 10 мл 80 .-ной уксусной кислоты и оставляют на 30 мин при . комнатной температуре. Затем концентрируют в вакууме при 50 С досуха, cF остаток растворяют в 25 мл воды и отщепленный диметокситританол экстрагируют 3 раза по 15 мл эфиром. Водную фазу снова концентрируют досуха, остаток растворяют в 2,5 мл воды, обессоливают на биогеле Р 2.(колонна:

60 .х 1,7 см) и диофилизируют.

В качестве контроля чистоты служит аналитическая HPLC-диаграмма. Колонна 300 х 3,9 мм, р -Bondapak C фирмы Waters элюанты: 0,1 И триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7 с 12 ацетонитрила; истечение 1,5 мл/мин, время удерживания 3,7 мин.

П P и м е Р 7. Синтез d-TAAGGAGGTTTA

Пример 10. Синтез d-AGCTTAAAGATG, Получают аналогично примеру 6 исЪ ходя из. 200 мг (16,2 мкмоль) .

DMTrdG Ь Р, 45 Примерно 25 мг плазмиды рВР 101 переваривают рестрикционной эндонуклеа-. зой Есо RI два образующихся фрагмента отделяют друг от друга путем гельэлектрофореза (1,4 агарозы) и фрага мент длиной 200 Ьр электрофоретически элюируют из геля. Этот фрагмент затем переваривают с помощью Нае III, оба продукта переваривания разделяют на б -ном полиакриламидном геле и фраг55 мент длиной 90 Ьр (промотор-оператор) снова выделяют из .геля.

RBS составляют из 3-х синтетичес( ких олигонуклеотидов: 6-мера 5 -ТССТТА, 10-мера 5 -AGCTTAAACC и 12-мера 5

7 141780

TAAGGAGGTTTA. 500 и-моль 6-мера фос.форилируют с помощью фермента поли1. нуклеотидкиназы и при этом радиоак4 тивно маркируют. Реакционную смесь в течение 10 мин нагревают при 70 С, чтобы инактивировать киназу, после чего добавляют эквимолярные количества (не фосфорилированных) 10-мера и 12-мера, смесь олигонуклеотидов нагревают до 90 С и затем медленно о (примерно через 3 ч) охлаждают. до 3035 С, причем олигонуклеотиды гибриди-.

0 зуются один с другим:

12 1ПеГ

5

НО у dATTCCTCCAAATTCGA

20 б пег 10 1Т1е1

Благодаря добавке 0,25 мкмоль АТР и 5 мкмоль ДТТ 6-мер и 10-мер с помощью фермента ДНК-лигазы ковалентно

25 связывают друг с другом. Отсутствие фосфатных остатков на 5 -концах 12I мера и 10-мера предотвращает возникновение многомерных продуктов лигатуры. После реакции осуществляют нагре- ЭС ванне в течение 10 мин при 70 С, чтоб бы инактивировать лигазу, после чего добавляют 0,5 ммоль ATP и 5 ммоль ДТТ в дальнейшую реакцию киназы также киназируют 5 -концы 12-мера и 10-мера, благодаря чему получается RBS, 12 пмоль Есо RI-Hae-III-промотороператорного фрагмента длиной 90 Ьр лигируют в стандартных условиях с помощью 60 пмоль RBS. Полученный благо- 40 даря Hae III разрезу тупой конец фрагмента размером 90 bp легируют с тупым концом RBS и получают молекулы, в которых содержат RBS в направлении ориентации вниз от промотора. После реакции лигазу инактивируют в течение 10 мин при 70 С устанавливают концентрацию ТА-буфера и дополнительно переваривают с помощью 200 единиц

Hind III и 10 единиц Fco RI.

В образующихся в реакции мультимерах наряду с желательной реакцией могут.лигироваться друг с другом как

Есо RI-концы, так и также Hind IIIконцы и снова превращаться в мономеры. Затем пробу разделяют на 6Х-ном полиакриламидном геле и вырезают из геля промотор-операторный RBS-фраг» мент. размером 100 Ьр, который имеет

0 8

Eco RI. — и Hind III концы электрофоретически элюируют, чтобы отделить от избытка нелигированного RBS. При этом ответствЕнная за экспрессию часть экспрессионного плазмида готона, Примерно 2 мг плазмиды рВЕ 322 разрезают с помощью рестрикционных ферментов Eco RI n Hind III, причем образуются два фрагмента:- большой с

4382 bp и малый с 29 bp. Большой фрагмент путем -электрофореза на 0 8Х-ном геле агарозы отделяют от маленького фрагмента, вырезают из геля и элюируют. Примерно 0,4 пмоль этого фрагмента затем лигируют с 10 (пмолями промотор) оператор-RBS-фрагмента.

pBR 322-фрагмент из-за своих двух не подходящих друг к другу выступающих концов не может лигироваться сам с собой, поэтому промотор-операторный

RBS-фрагмент может лигироваться только в одной ориентации в плазмиде в направлении Hind III-сайта, до тетрациклинрезистентного гена pBR 322.

Escherichia coli НВ 101 трансформируют с помощью реакционной смеси последнего лигирования известным образом, трансформанты селекционируют на содержащих ампициллин агаровых пластинках. Для этого Е-.coli НВ 101клетки выращивают до плотности пример» но 2 х 10 клеток/мл. Клетки пеллетируют и суспендируют в 100 мкмоль раствора СаС1 (20 при 0 С). После этого клетки инкубируют с реакционной смесью реакции лигазы в течение 5 мин при 0 — 4 С и в течение 5 мин при

37 С. После добавки 0 5-.1 мп 1-бульона инкубируют далее в течение 15-

30 мин при 37 С ° Выбирают 19 трансформантов и с помощью Нае III-рестрикционных перевариваний испытывают на их возможное содержание промотор-операторного RBS-фрагмента. pBR 322/НаеIII-фрагмент длиной 192 Ьр заменяют

264 Ьр-фрагментом (16 Ьр размером

Нае III с сайтом на конце в pBR 322

"влево" от Есо RI-сайта + 103 Ьр промотор/операторного RBS-фрагмента +

+ 145 bp Hind III-места среза вплоть до ближайшего Нае dIII-места среза

"вправо" от него, в рВВ. 322). Из 19 отобранных трансформантов 18 обладают ожидаемым образцом переваривания.

Для того чтобы установить правильность сконструированной экспресссионной плазмиды одну из этих плазмид

i2 П1Е 19mer

5 Л G С Т ТАЛЛ GAT С Т (TiGAT СТ С С СТ CA

У АТТТСТАСАСАСТАЖС

- J !

Hind Ш апре? 8mer — чаи gA

Met C c

9 14178 (pER 103) подвергают последовательному анализу и его положение устанавливают в pBR .322. Последовательный анализ проводят по методу Махаш u Gil—

bert в направлении от Есо RI-сайта в направлении Hind III-сайта (и сверх него), как также от Hind-III-сайта в направлении Есо RI-сайта (и сверх него) .

Плазмида рЕК 103 таким образом содержит промотор-операторную область триптофанового оперона Serratia marcescens в .комбинации с синтетической

RBS. Новая плазмида промотирует транскрипцию генов, которые встраиваются в его Hind III-сайт, и позволяет осуще, ствлять эффективную трансляцию этих продуктов транскрипции, 20

Пример 14. Примерно 1 мкг

Pst I-вставки 1F17 переваривают с по- мощью Sau ЗА и из 6%-ного полиакриламидного геля выделяют фрагмент дли. ной 177 Ър, который простирается от 2б

Sau ЗА-сайта íà NH<-концевом цистеиновом кодоне вплоть до ближайшего Sau

3А-сайта и содержит Ava III-сайт, Его обрабатывают 1 единицей щелочной фосфатазы и после удаления фосфатазы 30 благодаря экстракции фенолом и эфи ром осаждают с помощью этанола. Фрагмент затем обрабатывают Ava II, благодаря чему получают желательный фрагмент 34 Ър Sau ЗА-Ava II и 143 bp35 фрагмент.

Получают 4 синтетических олигонуклеотида, а именно 14-мер 55—

TGTGATCTGCCTCA, 12-мер 5 -AGCTTAAAGATG, 9-мер 5 -CAGATCACA и 8-мер 5 —

САТСТТТА.

По 250 пмоль 8-мера, 9-мера и

14-мера фосфорилируют после реакции киназу инактивируют путем нагревания при 95ОC, добавляют 250 пмоль некиназированного 12-мера и олигонуклео тидную смесь медленно (примерно

00 10

Параллельно этому из плазмиды 1F17 препарируют интерферонспецифический

Ava II-фрагмент размером 646 Ьр, который простирается от Ava Il-сайта внутри Sau ЗА-фрагмента размером

177 Ьр за концевой кодон. Примерно

0,5 мкг этого Ача II-фрагмента размером 646 Ьр вместе со смесью из

34 bp и 143 bp Sau ÇA-Ava

II-фрагментов инкубируют с ДНК-лигазой. Образующиеся благодаря этому фрагменты Ava II которые ковалентно связаны, фланкируют Ача II-Sau ÇAфрагментами. Как только Ava II-Sau

ЗА-фрагмент лигируется с фрагментом

Ava II на этом месте не может более происходить никаких других лигирова». ний, так как Sau 3A-концы дефосфорилируются. После лигирования осуществляют нагревание в течение 10 мин при

70 С, чтобы инактивировать фермент, затем добавляют 5 мкмоль ДТТ и

0,25 мкмоль ATP и дефосфорилированные

Sau 3A-концы снова кинезируют. Реакционную смесь разделяют на 6%-ном полиакриламидном геле и молекулы в области 700-800 Ьр (646 Ьр Ava II-фрагмент фланкирован двумя Ava II-Sau

ЗА-фрагментами) и в области 13001500 bp (два друг с другом лигированные 646 Ьр Ava II-фрагменты фланкиро ваны Ava II-Sau ЗА-фрагментами) элюируют.

Получение олигонуклеотидного комплекса формулы в. течение 3 ч) охлаждают до

35 С, чтобы сделать возможной гибридизацию олигонуклеотидов. Затем после добавки 5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль

ATP олигонуклеотиды лигируют друг с другом. Отсутствие фосфатного остатка на 5 -конце 12-мера предотвращает ( образование димеров; выступающий ко < нец 14-мера не самокомплементарен, он не может приводить к димеризации.

1417800

Аликвотную часть (25 пмоль) лигированного олигонуклеотидного комплекса переваривают с помощью 80 единиц

Sau ЗА, чтобы получить подобающий интерфероногену Sau ЗА-конец. Затем пробу нагревают в течение 10 мин при о

75 С, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Таким образом, последова- тельный фрагмент, который связывает интерфероноген с Hind III-.ñðåçàííûì

pER 103 согласно изобретению, готов.

Связывание интерфероногена и олигонуклеотидного комплекса, лигирование в pER 103.

Изолированные фрагменты интерфероыа, которые представляют собой примерно 1 пмоль молекул, связывают с

Sau ЗА-разрезанным олигонуклеотидным комплексом (примерно 25 пмоль) путем лигирования когазивных Sau ЗА-концов.

Снова отсутствие фосфатного остатка на Hind III-конце олигонуклеотидного комплекса (12-мер) предотвращает возникновение мультимеров, Образуются молекулы интерфероногена, которые с обеих сторон олигонуклеотидного ком-. плекса фланкированы свободными Hind

III-концами. После денатурирования при нагревании .лигазы и добавки .5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль ATP .эти . ° концы фосфорилируют, затем осуществляют, осаждение с помощью изопропанола, чтобы отделить также образовавшиеся в реакции лигирования димеры олигонуклеотидного комплекса. После этого конструкцию лигируют с помощью

0,05 мкг Hind III, обработанной эндонуклеазой и фосфатазой плазмиды РЕК

103. Обработка фосфатазой Ндпй IIIразрезанной плазмиды уменьшает его рециркуляцию в реакции лигирования. Таким образом, смесь плазмиды готова, . она содержит до 50Х продуцирующих интерферон плаэмид (а -именно тех плазмид,. которые получают из 34 Ър Sau

ЗА-Ava 11-фрагмента в лнгировании с помощью 646. bp Ava II-фрагмента на начале. гена, Трансформация F.scherichia coli.

НВ 101 и анализ трансформации в отношении продуцирования интерферона.

Полученными плазмидами трансформируют штамм Е.col i HB 101. Примерно

20Х полученных трансформантов имеют вставки, из которых многие исследуются на экспрессию интерферона. Для это.го 100 мл бактериальной культуры в И9 минимальной среде,, в которую добавлены все аминокислоты, кроме триптофана (20 мкг/мл на аминокислоту), а также тиамин (! мкг/мл); глюкоза

5 (О 2Х) и индуктор триптофаноноперона индол-(3)-акриловая кислота (?АА, 20 мкг/мл, выращивают до оптической плотности 0,6-0,8.- Бактерии пеллетиВ руют благодаря центрифугированию в течение 10.мин при числе оборотов

7000 в мин, промывают 1 раз 50 мп трис-НС1, РН 8, 30 мкмоль NaCl и суспендируют в 1,5 мл такого же буфера.

После инкубации с 1 мг/мл лизозима !

5 в течение 30 мин на льду бактерии пять раз замораживают и оттаивают и затем удаляют фрагменты клеток путем центрифугирования в течение 1 ч при

40000 об/мин. Надосадочную жидкость стерильно отфильтровывают и испыты- . вают в тесте по уменьшению пятен с

V3 — клетками и вирусом Vesicular

Stomatitis на интерферонную активность.. Примерно половина всех клонов

25 (со вставками) обладает значительной интьрферонной экспрессией: 2х108 еди— ниц (международные стандартные единицы) на 1 л культуры.

Выбирают один из этих продуцирующих интерферон клонов .(pER 33) H QT промотор-операторной области подвер.гают последовательному -анализу далее вплоть до интерфероногена, чтобы установить правильность сконструирован35 ного плазмида. Последовательный ана:лиз снова осуществляют по Иахат и

Gilbert от радиоактивно маркирован-. ного на 3 -конце Есо RI-сайта в направлении интерферонгена °

Плазмида pER 103 содержит промотороператорную последовательность триптофаноперона Serratia marcescens в комбинации с синтетической последо вательностью рибосомного связывания.

45 Встроенные в плазмиду pER 103 пригодным образом гены показывают высокие значения экспрессии. Плазмида pFR 103 штамм бактерий в Е.coli К,, НВ 101 сдана на хранение в немецкое собрание микроорганизмов, GrisebachstraBe S, 3400 Геттинген/ФРГ, под номером ЭЯ1

2773 от 27 октября 1983 г„ согласно

Будапештскому договору.

Пример 15. 2 мкг pER 33 разре55 . зают с помощью рестрикционной системы

Есо RI u Ham HI, благодаря чему образуются два фрагмента длиной примерно 1300 bp и примерно 4000 bp. Эти фрагменты разделяют электрофоретичес141780

13 ки на 1,2 .-ном агарозном геле. Более короткий фрагмент выделяют из геля путем электрозлюирования. Концы этих

ДНК благодаря добавке по 1,25 нмоль

dATP, dGTP, dCTP и dTTP, а также 2-х единиц Klenov-фрагмента ДНК-полимеразы l переводят в тупые концы. ДНК очищают путем экстракции фенолом и осаждения из этанольного раствора и 10 затем растворяют в 15 мкл Н О.

Примерно 15 пмоль Есо RI-линкера с фосфорилируют по 5 -концам путем добавки 1 -р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы в 5 мл реакционного раствора. 15

После инактивации нагреванием киназы добавляют 5 пмоль ATP и О, 1 единицы

Т4-лигазы и инкубируют 16 ч при 14 С.

Реакционный продукт очищают путем осаждения изопропанолом от низкомоле- 20 кулярных веществ.

ДНК затем разрезают с помощью

20 единиц рестрикционного фермента

Есо RI еще раз очищают путем осаждения изопропанолом и растворяют в

10 мкл воды.

Примерно 2 мкг pER 33 обрабатывают рестрикционным ферментом Есо RI. Затем добавляют щелочную фосфотазу, чтобы удалить 5" -фосфатные остатки 30 длиной примерно 5300 Ьр, линейную

ДНК путем электрофореза в 1,2%-ном геле агарозы и электроэлюирования очищают от остаточной не разрезанной

pER 33. ДНК экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают из этанольного раствора и растворяют в !0 мкл воды.

4 мкл снабженного Есо RI-линкерами

ДНК-фрагмента, который содержит IFNaAген плюс регуляторные элементы лиги- 4р руют друг с другом с 0,5 мкл обработанной Есо RI и дефосфорилированной

pER.33 плазмидой в 20 мкл реакционного раствора с помощью О, 1 единицы о

Т4-лигазы. После инкубации в течение

16 ч при 14 С фермент разлагают путем нагревания прн 68 С. о

Escherichia coli НВ 101 трансформируют аналогично примеру 1, Два из п таким образом полученных клонов испытывают аналогично примеру 2 на экспрессию интерферона посредством теста на уменыпение пятна. В то время как клон pER 33 содержит до 200 х 10 еди. 5В

5 ниц IFN на 1 л культуры, с помощью одного из новых клонов pER 21/1 получают более чем 300 х 10 единиц на б

1 л культуры, 0 14

Плазмиду pER 21/1 выделяют в большом количестве и апапизируют с помо щью переваривания рестрикционными ферментами с помощью Hind III. Так как введенная в pFR 33 вместо Есо RI

ДНК имеет два идентичных Есо КЕ-сайта, то возможны две ориентации этой

ДНК и pER 21/1. Рестрикционное ферментное переваривание плазмиды pER

21/ 1 Hind III 2 1/1 с параллельно направленными интерферонгенами должно давать фрагменты примерной величины 4 100, 950 (2 фрагмента) и 450 Ьр.

Когда оба гена ориентированы противоположно, размеры фрагментов следующие

4350, 950 (2 фрагментаз.и 200 Ьр. Переванивание примерно 2 мкг pER 21/1 с помощью рестрикционной системы Hind

III и последующий электрофорез в

1,4 -ном геле агарозы дают фрагменты примерной величины 4100, 950 и 450 bp.

Поэтому оба IFNaA-гена ориентированы параллельно друг другу.

Пример 16. Примерно 200 пмоль

Есо RI линкера (New England Biolabs..

Inc.) в 20 мкл реакционного раствора фосфорилируют на концах с помощью.

9 единиц Т4-полинуклеотидкиназы и

10 пмоль АТР, затем фермента.инактивируют при нагревании.

8 мкг плазмиды рРИ 31 разрезают с помощью эндонуклеазы Ava,1. Концы этой разрезанной плазмиды путем добавки по 5 пмоль dATP, dGTP,,dTTP, а также 4 единиц фермента Klenowфрагмента полимеразы 1 переводят в тупые концы.ДНК очищают путем экстракции фенолом и осаждения из эта ". нольного раствора и растворяют в

40 мкл воды.

Есо RI линкер вместе с,обладающей линеоризованными и тупыми концами ДНК в 70 мкл реакционного раствора с

6 пмоль АТР и 1 единицей Т4-лигазы обрабатывают 16 ч при 14 С. После инактивации фермента при нагревании в растворе устанавливают рН 7,6 с помощью 50 ммоль NaC1 и 50 мкмоль трис-С1 и ДНК обрабатывают 300 едини цами Eco RI. Спустя 2 ч времени инкубации рестрикционный фермент денатурируют при,нагревании и ДНК отделяют электрофоретически в 1,4 -ном геле агарозы. Содержащий par-Lokus отрезок ДНК примерно длиной 400 Ьр электроэлюируют из геля, очищают путем экстракции фенолом и осаждения из этанольного раствора и растворяют

1ч 1; 800

16 в 50 мкл воды. Этот отрезок ДНЕ имеет специфические выступы на своих ко!ьцах Есо Rl

Примерно ? мкг рЕН 33 обрабатывают с помощью рестрик!!ионного фермента Eco RI. Затем добавляют щелочную г фосфатазу, чтобы удалить 5 -фосфатные остатки..Пинейную DNS длиной

5300 bp очищают путем э.!!ектрадареза 10 в 1, 27.-ном геле агарозы и электроэлюHpoB

ДНК-раствор экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают из этанального 15 раствора и растворяют в 50 мкл воды.

1 мкл разрезанной плазмидной ДНК лигируют с 1 мкл par — Lokus ДИК в

20 мкл реакционного раствора с помощью О, 1 единицы Т4-лигазы. После 20 инкубации в течение 16 ч при 14 С фермент инактивируют нагреванием.

Escherichia co1i НВ 101 трансформируют аналогично примеру 1. Получают примерно 50 колоний. Из 10 этих кола- 25 ний выделяют незначительное количество плазмида ДНК и разрезают с помощью рестрикционного фермента Pst 1, Из анализа путем электрофореза в агаразе следует, что все плазмиды содержат 30 примерно 400 Ьр длиной par-Lokus.

Выбирают один из этих плазмид и обозначают par pER 33.

Аналогично примеру 2 культивируют бактерии, которые содержат либо pER, либо par pER 33, и затем испытывают в тесте с уменьшением пятна на содержание интерферона. Оба штамма показывают примерно один и тот же уровень 40 экспрессии интерферона.

В опыте, осуществляемом длительное время, который распространяется на

120 генераций бактерий, исследуют стабильность плазмидов pER 33 и par 45

pER 33 и Escherichia coli НВ 101 в от- сутствии селекционного давления благодаря антибиотику ампициллину. В регулярные интервалы берут из культуры пробы и испытывают бактерии на содер-.50 жание интерферона.

Из этого устанавливают, что pER 33 бактерии, содержащие pER 33, после примерно 60 генераций продуцируют интерферон. Бактерии, которые содержат

par pER 33, продуцируют интерферон . .

A спустя еще 120 генераций.

Таким образом, показано, что введение par-Lokus в pER 33 (par pER 33) повышает стабильность плазмиды в

Евс1!(г ch !.;! col i НВ 101.

Фoðìóлаизoáрeòeния

1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рЕК-33, кодирующей зрелый о!-интерферон человека г!утел! выделения промотор-операторной области размером 90 Ьр из плазмиль!

pHR !01 в результате обработки фрагмента ДНК, кодирующего тринтофановый оперон Serratia marcescens размером

1000 bp энцонуклеазами Fco RI 6-мера

5 -GAATTC и Нае III 4-мера 5 -GGCC,,конструировании последовательности рибосомного связывания — И58 из трех синтетических олигонуклеотпдов

6-мера 5 -ТССТТА, 10-мера 5 — .

AGCTTAAACC и 12-мера 5 -TAAGGAGGTTTA, с последующим лигированием Есо RIHae III-фрагмента, кодирующего промотар-операторную область с последовательностью рибосомного связывания и дальнейшим встраиванием промотороператорного RBS-фрагмента в плазмиду pBR 322 путем лигирования большого фрагмента Есо RI-Hind III размером 4332 Ьр с промотор-операторомRBS фрагментом, с последующей трансформацией бактерии Escherichia coli полученными рекомбинантными плазмидами и отбором клонов, содержащих плазмиду рВ!(103, при этом структурный ген a -интерферона получают в результате лигирования Ava II-фрагмента размером 646 Ьр из Pst I-вставки клона 1F7 со смесью фрагментов размерам 34 Ьр и 143 Ьр, полученных в результате обработки Pst I-вставки клона 1F7, эндонуклеазой Sau 3A, фосфорилированием полученного фрагмента длиной 177 bp с последующей обработкой Ava II-эндонуклеазой и связыванием с олигонуклеотидным кол!плексом сконструированным из синтетичесУ гI ких олигонуклеотидов 14-мера 5

ТСТСАТСТСССТСА, 12-мера 5 -AGCTTAAAGATG)

9-мера 5 -CAGATCACA и 8-мера 5—

САТСТТТА, лигаты фосфорилируют и сшивают с 0,05 мкг Hind III, разрезанного и обработанного фосфотазай

pER 103 с последующим трансформированием штамма бактерий E.coli НВ 101 полученными плазмидами и отбором клонов, содержащих конечную плазмиду, 2. Способ па п. l, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышеl8

7800

Техред Л.Олийнык Корректор M.Uàðoïïè

Редактор М. Недолуженко

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4080/59

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4!

7 141 ния стабильности плазмиды, плаэмиду

pFR 33 обрабатывают Есо RI-эндонуклеазой и щелочной фосфазой, фрагмент. размером 5300 bp связывают с par-Lokus, который получают путем лигирования Eco RI фосфорилированного линкера с 8 мкг плазмиды рРМ 31, предварительно расщепленной Ача I-эндонуклеазой и эатупленной с помощью фрагмента

Klenow полимераэы I в присутствии

dATP, dGTP, dGTP и dTTP, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Е.coli НВ 101 и отбирают клоны, содержащие плазмиду par pER 33.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю — . шийся тем, что, с целью повышения выхода 0(-èíòåðôeðoíà, концы Есо

RI-Ваш Н1-фрагмента размером 1300 Ьр плазмиды pER 33 затупляют К1епоы-фрагмента ДНК полимеразы I в присутствии

dATP, dGTP, dCTP u dTTP и лигируют . с Есо RI фосфорилированным линкером, попученный фрагмент встраивают в линеариэированную плазмиду pER 33, обрабатывают щелочной фосфатаэой и лигируют с выделенным ранее геном,