Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к мембранному белку еsснеriснiа coli в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для.очистки рекомбинантного интерлейкина- 2 (РШ1-2) человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к мембранному белку Е.соИ м.м. 45 кД, содержащемуся в препарате частично счищенного РИЛ-2 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, .иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы X63-Ag.B-653. Штамм продуцирует МКА в концентрации 25-30 мкг/мл культуральной среды и 10-12 мг/мл асцитической жидкости. МКА относятся к классу IgGi. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком E.coli 45 кД. Содержание примесного белка E.coli в РИЛ-2 человека после очистки на сорбенте, содержащем по- .лученные МКА, составляет 10%.1 табл. i (Л

СОЮЗ СОНЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)4 С 12 N 5 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ t (21) 4242063/28-13 (22) 12,05,87 (46) 23.12,88. Бюл. В 47 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (72) А.В.Панютич, Н.Н.Войтенок, О.А,Осипович и А.Ю.Циманис (53) 578.085.23 (088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS NUSCULUSo uC

ПОЛЬЗУЕИЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МЕМБРАННОМУ БЕЛКУ

ESCHERICHIA СОЫ .,В ПРЕПАРАТЕ РЕКОМБИНАНТНОГО HHTEPJEAKHHA-2 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для.очистки рекомбинантного интерлейкина 2 (РИЛ-2) человека. Целью изобретения является получение штам„„SU„„1446154 А1 ма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus продуцирующего моноклональные антитела (ИКА) к мембранному белку Е.со1г м.м. 45 кД, содержащемуся в препарате частично очищенного РИЛ-2 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/с, .иммунизированных

РИЛ-2 человека, с клетками миеломы

Х63-Ag.8-653. Штамм продуцирует МКА в концентрации 25-30 мкг/мл культу" ральной среды и 10-12 мг/мл асцитической жидкости. МКА относятся к классу IgGl. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком

Е.coli 45 кД. Содержание примесного белка Е,coli в РИЛ-2 человека после очистки на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 10Х. 1 табл.

1446154

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки рекомбинантного интерлейкина-2 человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к мембранному белку Е.coli10 м.м. 45 кД, содержащемуся в препарате частично очищенного рекомбинантно." го интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВаlЬ/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД

РИЛ-2 человека в О, 15 мл О, 15 M NaC1 в смеси с равным объемом полного адьюванта Фрейнда. Иммунизации повторяют 3 раза через 14 дней тем же количеством антигена в смеси с неполным адьювантом Фрейндак 3а 3 дня до слияния РИЛ-2 вводят внутрибрюшинно

0,5. мл 0,15 M NaC1. Гибридизацию

1х10 клеток селезенки иммунных мы- 25 шей и Зх10 " клеток миеломы мыши

Х63-Ag: 8-653 проводят 50 .-ным раствором полиэтиленгликоля мол.массы 4000, содержащего 5Х диметилсульфоксида, в течение 1,5 мин. После гибридиза- 30 ции и отмывки клеток от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные панели по 1х10 спленоцитов в

Я лунку. Для культивирования и селекции гибридом. используют среду ТМДМ (модифицированная Iskove s среда Дульбекко) с добавлением 10 эмбриональф ной телячьей сыворотки (ЭТС), 10 М гипоксантина, 4х10 М аминоптерина и 1,6х10 М тимидина. Гибриды"проду-,0 центы клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4х10 < клеток селезенки. После 2 клонирований практически 100Х субклонов продуцируют

MKA к антигену Е.coli.

Наиболее продуктивный штамм выводят в массовую культуру и обозначают

22А1.2. Штамм 22А1 ° 2 хранится в

Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоноч50 ных Института Цитологии АН СССР под номером BCKK(l N 112Д, и характеризуется следующими признаками, Культуральные признаки. Среда культивирования — среда ТМДМ с 10Х

55 донорской телячьей сыворотки, 2 мМ

1.-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола, при 37 G и в атмосфере 5 . СО q °

Для выращивания штамма используют стеклянную посуду, посевная доза

?00 тыс. клеток на 1 мл клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:6 ° 1:8.

Культура суспенэионная.

Культивирование в организме животных. Для выращивания аспита пригодны мыши ВаlЬ/с. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшиннно по 0,5 мл пристана.

Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 ° 10 клеток в 1 мл среды ТМДМ.

Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма ° Секреция моноклональных антител на 2-3 день культивирования составляет 25-30 мкг в 1 мл культуральной среды и 1012 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полезного продукта. Штамм продуцирует моноклональные антитела изотипа IgG1, Специфичность - мембранный белок E,coli с мол.массой 45000, содержащийся в пре парате РИЛ-2 человека. Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание МКА с иммобилизованным частично очищенным РИЛ-2 (иммуноферментный анализ).

Продукция МКА- сохраняется как ми)нимум до 10 пассажей in vitzо, В асцитной форме штамм не пассируется более одного раза.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре лне обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено по характеру включения тимидиновой метки °

Криоконсервирование, Для длительного хранения . клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10 диметилсульфо оксида. Режим замораживания: 1 С в

1 мин до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот, Раэморажйвание — на водяной бале при

+3? С. Жизнеспособность клеток после

0 размораживания 70-80, по окрашиванию трипановым синим.

II р и м е р 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флак он объемом

50 мл по 1х10 клеток в 5 мл среды

ТМДМ с 10Х ЭТС, 2 мМ I,-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомици1446154

РИЛ-2, частично очи- щенный

2143

Растворимые белки

Е.coli

509

Мембранная фракция

Е.coli

1573

171

БСА на, 0,05 мМ меркаптоэтанола (МЭ) .

Клетки культивируют 2-3 для при 37 С в атмосфере 5Х СО, Полученный супернатант используют в качестве реагента в иммунохимических реакциях (как препарат МКА) °

Антигены высушивают в лунках

96-ячеечных микроплат при 37 С или о

20 С в следующих количествах: частично очищенный РИЛ-2 (150 нг в 20 мкл бидистиллированной воды, мембранная фракция, растворимые белки Е.coli и бычий сывороточный альбумин (ЕСА)по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма 22А1.2. Панель инкубируют 2 ч о при 20 С, затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по

50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченые пероксидазой, разведенные 1/2500 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, О, 15 М NaC1, 1 БСА (3ФР-БСА). После инкубации в течение

1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки добавляют субстрат — ортофенилендиамин гидрохлорид (0,6 мг/мл) в цитратно-фосфатном буфере рН 4,7, содержащем 0,09Х Н О ) ..Реакцию останавливают через 10 мин 1М . серной кислотой и учитывают на спектофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты исследований представлены в таблице

Антигены Культуральная среда штамма 2?А1.2 А492, х 10

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о высокой специфичности МКА полученного штамма к мембранному белку Е.coli.

Пример 2. Электрофорез в

i5X-ном полиакриламидном геле в при5

45 сутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использованием аппарата для вертикального электрофореза, 10 мкг РИЛ-2 в буфере для образца, содержашем или не содержащем

Мэ (редуцирующие и нередуцирующие условия) и эквивалентное количество лизата Е.cali в буфере для образца с Мэ прогревают 2 мин при 100 С и наносят в ячейки геля. Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 50 мА.

Электроперенос разделенных компонентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ) -c диаметром пор 0,45 мкм проводят в течение 1 ч. После переноса НЦ промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набора для иммуноблотинга, Неспецефическую сорбцию белка на НЦ блокируют в

0,02 М трис-НС1 буфере рН 7,4 с

0,5 М NaC1 (ТБР), содержащем ЗХ желатины. После этого НЦ промывают

2 раза ТБР с 0,05Х твин-20 (ПЕР) и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДНС-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих условиях и лизата E.coli помещают в стеклянные пробирки емкостью 15 мл и добавляют 10 мл супернатанта МКА

22А1.2.

Инкубацию с YEA продолжают 2 ч о при 20 С на аппарате с горизонтальным перемешиванием. После этого HII отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, 1добавляют козьи антимьппиные антитела, разведенные 1/2000 в TTFP, 1Х БСА и инкубируют 1 ч при 20 С с перемешиванием. После 2 отмывок ТТБР и од" ной отмывки ТЕР реакцию проявляют в растворе субстрата, содержащем

4-хлор-1-нафтол и 0,015Х Н О g в течение 20 мин. Для хранения и фотографирования НЦ промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии полученных антител с белком E coli с м.м. 45 кД.

Электрофоретическая подвижность белка Е.coli при ДСН-ПААГЭ одинакова в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Полученные антитела могут быть эффективно использованы для очистки

РИЛ-2 человека, Содержание примесного белка Е.coli в РИЛ-2 человека после очистки на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 10Х.

Составитель М.Серова

Редактор Н.Гунвко Техред Л.Олийнык Корректор М.Максимишинец

Заказ 6706/3

О Тирам 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1446154 6

Ф о р м у. л а и з о б р е т е н и я чения моноклоналвных антител к мемШтамм гибридных культивируемых бранному белку Escherichia coli в клеток животных Nus musculus ВСКК препарате рекомбинантного интерлей(II) N 112D, используемый для полу . кина-2 человека,