Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus вскк (п) n 62 d, используемый для получения моноклональных антител к мyсовастеriuм тuвеrсulоsis

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики туберкулеза Целью изобретения является полз генне штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные -антитела (МКА) к цельным микобактерням чепопака штамма ,,. получают гнбр; :-- дизацией клеток селезенки, мыгаей BALB/C, иммунизированных авируленэ ным штаммом , с клетками миеломы PJ О. Секреция МКА на 3-4 деш культивирования составляет 45 - - 55 мкг/мл культуральной среды и б - 8 мг/мл асцитической жидкости М5СА относятся к классу они специ - чески связы1эаготся с антигенами цельных микобактерий человека Hj7 Чр 1 табл.

союз соеетсних социАлистичесних

РЕСПУБЛИН

1ОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ

<19) НН 3

t (51)5 С 12 N 5/00 А 61 К 39 40 (46) 23. 12. 90. Бюл. М- 47 (2i) 4237397/23-13 (22) 28,04.87 (71) Московский научно-исследовательский институт туберкулеза и Инс. титут экспериментальной кардиологии

Всесоюзного кардиологического науч" ного центра AMH CCP (72) M.В.Андросова, И.Н.Трахт . и М,А.Владимирский (53) 578.085.23 (088.8) (56) A.Í.I.Kolk et. а1. Т.C1in апй

gxpа immundó 1984у v.58 N Зу pà,511 (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВКРУЕ41Х

MUH t MU8CUI.U8, ПОЛЬЗУЕМЫЕ ДПЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКПОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МУСОВАСТЕВПМ .ИВЕН-.

СШОЯХВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики туберкулеза, Целью изобретения является пол.."-1 ение штамма гибридиьп культивируемых клеток

Мцз шцвсц1цв, продуцнрЪ| щего моноклональные антитела (МКА) к цельным микобактерням человека штамма Нз R,ö. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки, мьппей

BALB/ñ, иммунизированных авирулентным штаммом Н 7Rö, с клетками миеломы P 01 Секреции MKA иа 3-4 день культивирования составляет 45-55 мкг/мл культуральной срецы ч 68 мг/мл асцитической жидкости. ЯКА относятся к классу I Ci оки спиюФически связываются с антигенами цельных микобактерий человека штамма

Н>> R, 1 табл.

l 4451

Изобретений. относится к биотехно-. логии и может бить использовано для диагнос"ики туберкулеза.

Пель изобретения - получение штамма гибридных куль.тивируемых клеток

5 животных Mus musculus, продуцирующего специфические моноклональньте ан титела (МКА) к цельным МусоЬас1ег ттттт

tuber< ulosi s.

Штамм получатот следующим образом.

Мышей линии BALH/с иммунизируют авирулентным штаммом микобактерий туберкулеза Н Hä . 4 инъекции по 0,2 мг полувлажной массы подкьжно в течение

5 мес. Через 48 ч после трех ежедневных виутрибрюшинных буст-инъекций по

0,2 мг белка сониката (надосадок разруленньтх ультраг -уковой обработкой мнкобактерий) Н В и БЦЯ в равном соотношении берут селезеночные клетки для проведения слияния. Гибриди -. зацию селезепочных клеток и клеток мышиной миеломы Р 01 проводят в соот" ношении 5:l с помощью 50% ттолиэтилен- 2$ гликоля (мол.м. 3500)..Клеточную смесь разливают в 96-луночные плгсти" ны по 2 ° 10 спленоцитов на лунку, Для культивирования и селекции гибридов используют среду BPMI-1640 с добавлением 10 лошадиной и .О те-", ф лячьей эмбриональной сыворотки, 10 Ч

-7 гипоксантина, 4 10 И аминоптерина и 1,6 ° 10 И тимидина. Культуральную жидкость, гибридных клеток проверяют на содержание антител, специфически свяэызающихся с антигеном микобактерий;еповеческого вида штамма Н Я (надосадок разрушенных ультразвуком микобактерий) в твердофазной радиоиммунной реакции. Отобранный из 500

i гибридных клонов клон 502 продуцирует в культуральную жидкость ан" титела, связывающиеся в радиоиммун- ной и иммуноферментной реекциях лишь с антигенами Нэ Я,Клетки этого клона дважды клбнируют методом конечных разведений по 2 клетки на лунку, соде;лежащую в качестве ттподпожки™ 4 10 клеток селезенкив После BToporo клонирова

50 яия 98 субклонов продуцируют антители указанной выше сп "цифичности.

Их продукция сохраняется в течение

8 пассажей в культуре клеток, Чйсть гибрндомных клеток 502 замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10, ДИСО в жидком азоте для хранения. Другую часть исполь84 2 Ю .т утят для и ол уч ения гибридной опухоли в лстпттнотт форме у милей ВА1В/с введением виутрибрюшинно (2-R) 10 клеток мтттттам, подготовленным внутри-. брюлинной инъекцией 0,5 мп вазелинового масла эа 3-30 дней до инъек-; ции штамма. Асцит образуется через

1. — 16 дней.

Полученный штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных

Института цитологии АН СССР под номером 62D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда

BPMl 1640 с 10 телячьей эмбриональной сыворотки и 1О лошадиной сыворотки, 4,мМ Т -глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 м11 пирувата натрия, аминокис- " лотами для базальной среды Игла, ви" таминатти для среды Игла 0,05 .мМ меркаптозтанола, при 37 C и в атмосфере 5Х углекислоты.

Для выращивания штамма используют пластиковую посуду; посевная доза

100 тыс. клеток/мл, клетки пассируют

1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1!10. Культура суспензионная.

Для выращивания опухоли пригодны мыли HALH/c. Свежим мышам за 3— 30 дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл вазелинового масла. Штамм инъецируют внутри- брюшинно по (2-5)"10 клеток в 1 мп, б среды Игла. Асцит образуется через

12-16 дней. Штаммы не перевчвали.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет 45

55 мкг в l мл культуральной среды и 6"8 мг в 1 мл асцитической жидкост ти при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции.

Характертстика полезного продук:та. NKA относятся к классу Igh Они обладают избирательнгй специфичностью к asmr esax Mycobacterium tuberculosis, Стабильная секреция продукта сохраняется до 8 пассажей in vitro, Контаминация. Контаминация бактериями, грибами микоплазмой не обнаружена, Криоконсервирование. (0,7 — 1)"10 клеток штамма консервируют в 1 мп телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание з 14451 проводят в программ Ом амораживателе пО следующей программе: температуру снижают по 4аC R 1 мин до 4 С и по l С в 1 мин до -40 . Клетки храа а нят в жидком азоте. Размораживание:

5 о бЫстро при 37 С. Жизнеспособность после размораживания по включению трипанового синего 70-807,.

Пример. Гибридомные клетки, хранящиеся в жидком азоте, размораживают быстро при 37 С, Отмывают средой 199 и высевают в среду для культивирования кОторая: состоит из

НРМ1-1640 с,добавлением 107. телячьей эмбриональной сыворотки, 101 лошадиной сыворотки, 4 мМ -глютaмина, 10 мМ пи -увата à, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина,аминокислот для базальной среды Игла. витаминов для среды Игла и A 05 мм мерФ д каптоэтанола и выращивают при 37 С в атмосфере 5%-ной углекислоты. Посевная доза 10 клеток в 1 мл, Через

3-4 дня концентрация антител в куль- 25 туральной жидкости достигает 45

55 мкг/мл.

0,95+ 0,05

0,i 3 0.02

A I-I4+ 0,03 с;1г 1 A ,/ .р1

A

/

Эти результаты свидетельствую о том, что полученные ИЕА спещ.:фически взаимодействуют с ИусоЬас Leritu!I

1цЬегси1оЫ в, что позв Оляет полу ить на их основе эа,"фективные диагнос чческие препараты.

o p u V л а и з o o op e т е н и я

Штамм гибридных культивируемых клеток животных fus musculus BCKK

{П) N 62 D, используемый для получе45.ния моноклональных антител к Nyco- 0acterium 1цberculosis

Состави,,ь М.С рова

Техред M.Õîäàíè÷

Редактор С.Рекова

Корректор С,Пекмар

Тираж 497,Заказ 4331

Подпи с кое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, И-35, Раушская наб, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул, ПроектнaH., @.Специфичность взаимодействия антител с микобактериями туберкулеза человеческого вида выявляют твердофазным нммуноферментным методом, Дпя этого на полистироловую 96-луночную панель для микротитрования сорбируют убитые гамма-облучением микобактерии: 100 мкг культуры на ячейку в 200 мкл карбонатно-бикарбонатного буфера (0,02 N, рН = 9,6) при 37 С

R течение ночи. После насыщения панели 10%-ным раствором яичного белка в фосфатно-солевом буфере (0,02 И рН 7,4) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком в ячейки панели вносят 200 мкл культуральной среды штамма 582 íà 1 ч,после чего панель трижды отмывают водо84

4 проводной водой, а потом водой с

0,05У твина 20 (процедуру отмывки повторяют трижды), вносят конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мъппи, ковалентно связанных с пероксидаэой (1:1600, 37 С, 1 ч-), После окончания инкубацни несвяэавшиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связавшуюся пераксндазу (а значит, и антитела против микобактерий туберкулеза) определяют количественно по расщеплению субстрата (HgAg) йтаммы микобактерий имеют следукьщие пЬкаэатели оптической плотности: ч. н„я>

М. БЦЖ

И. bovinus-8

"Клинические" культурь1 (выделенные от больных) и = 96

И. avium

М. sегоfulacoп-.", М. п1гасе11п-.

larae

М. kansasii

М. Smepmatid

М. fortuitum