Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l.,используемый для получения моноклональных антител к @ - цепям иммуноглобулинов человека и обезьян

 

Изобретение относится к биотехнологий и может быть использовано в медицине для тестирования патологических состояний человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток. животных Mus muscules, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к общей приматовой детерминанте 51 - цепи иммуноглобулинов человека и обезьян . Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьшей линии BALB/c, иммунизированных секреторным Ig А из молозива человека, с клетками миеломы X63-Ag 8,653. МКА относятся к классу Ig 62а и преципитируют Иммуноглобулины человека в присутствии ПЭГ-бООО.Концентрация МСА в культуральной жидкости составляет 10мкг/мл, асцитической - 10 мг/мл. Использование МКА показывает , что уровни иммуноглобулинов в сыворотке обезьян варьируют от 65 до 105% от такОвых у человека. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК списочник изоБркткНия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4270144/28-13 (22) 15. 04. 87 (46) 07.12.88. Бюл. У 45 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии АИН СССР (72) И.Н.Клоц, А.Ф.Воеводин, Е.Н.Раэмадзе, И.Г.Зоделава и Т.Э.Оганян (53) 578.085.23(088.8) (56) Immunologу, 1986, 59, р. 467-473. (54) ШТАМИ ГИДРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОHAJIbHblX АНТИТЕЛ К Л-ЦЕПЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА И ОБЕЗЬЯН (57) Изобретение относится к биотехнологии и может.быть использовано в медицине для тестирования патологи„„Я0„„14425 5 а1 (59 4 С 12 N 5/00 А 61 К 39/395 ческих состояний человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus muscules, продуцирующего моноклональные антитела (NKA) к общей "приматовой" детерминанте gl— цепи иммуноглобулинов человека и обезьян. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьппей линии BALB/с, иммунизированных секреторным Ig А из молозива человека, с клетками миеломы Х63-Ag

8.653. МКА относятся к классу Ig 62а и преципитируют иммуноглобулины человека в присутствии ПЭГ-6000. Концентра ция МКА в культуральнойжидкости составляет 10мкг/мл, асцитической—

10 мг/мл. Использование 11КА показывает, что уровни иммуноглобулинов в сыворотке обезьян варьируют от 65 до

105Е от таковых у человека.

1442545

Продуктивность штамма. Концентра" ция МКА в культуральной жидкости составляет около 10 мкг/мл, асцитической — 10 мг/мл. Титр ИКА в культуральной жидкости 10, асцитической—

10 при определении твердофазным иммуноферментным методом. Стабильная продукция антител сохраняется в течение 10 пассажей in vitro.

Характеристика полезного продукта.

MKA относятся к классу Ig 62а, они взаимодействуют с общей "приматовой" детерминантой 3 -цепи иммуноглобулинов человека и обезьян. MKA преципитируют иммуноглобулины.человека в присутствии ПЭГ-6000 (реакции встречной и радиальной иммунодиффузии).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для тестирования патологических состояний человека, а также для работ в области приматологии.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных 1us musculus, продуцирующего моноклональные антитела (ИКА) к общей "приматовой"детерминанте ф -цепи иммуноглобулинов человека и обезьян.

Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BAI B/с, иммунизи- 15 рованных секреторным IgA из молозива человека, с клетками миеломы Х63-Ag

8.653. Слияние проводят с помощью ПЭГ6000.

Отбор клонов ведут на селективной 20 среде ГАТ и выявляют клоны нужной специфичности. Перспективный штамм н выводят в массовую культуру, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток поз- 25 воночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 91D.

Культуральные признаки. Среда культивирования — среда RPM1-1640 с

15% эмбриональной телячьей сыворотки. 30

Клетки культивируют при 37 С в 5%

СО . Посевная доза 5 ° 10 кл/мл; кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Для выращивания клеток используют стеклянные или

-пластиковые флаконы на 50-250 мл.

Мышам линии BAI B/с, обработанным пристаном, вводят 5-10 млн гибридных клеток, асцит образуется через 1020 дней.

Контаминация. Контаминация бактериями, грибами и микоплазмой не обнаружена.

Криоконсервирование 5-6 ° 10 клеток замораживают по программе в жидком азоте. Среда консервирования — эмбриональная телячья сыворотка и диметилсульфоксид. Жизнеспособность клеток после размораживания 90%-.

Пример 1. Навески иммуноглобулинов IgG, IgA u IgM в количестве

15 мкг на трек кипятят на водяной бане в течение 5 мин в буфере, содержащем меркаптоэтанол. При этом происходит разрушение дисульфидных связей и при электрофорезе иммуноглобулины разделяются на составляющие их полипептидные цени, Электрофорез проводят на 5-20% градиентных полиакриламидных гелях при постоянной силе тока, в двух параллельных образцах. Половина геля окрашивается красителем Кумасси голубым для визуализации белковых полос, из другой половины геля белки элюируют электроперекосом на лист нитроцеллюлозы, обладающей способностью сорбировать белки за счет физйческой адсорбции. Полученный лист нитроцеллюлозы или "блот" блокируют в растворе S%-ного сухого молока для блокирования всех незаполненных адсорбционных. точек блота. Блот инкубируют 2 ч при о

37 С с культуральной жидкостью, содержащей МКА, а затем с антимышиным пероксидазным коньюгатом, который связывается с ИКА. После отмывки несвязавшегося конъюгата блок инкубируют с раствором диаминобензидина.

Пероксидаэа в присутствии перекиси водорода переводит диаминобенэидин в окрашенное соединение. В результате на блоте появляется окрашенная полоса только в тех местах, где МКА взаимодействуют со своим антигеном.

При этом выявляют легкие цепи Ig с м.м. 25 KD.

Пример 2. В лунки 96-луночной панели вносят параллельно сыворотки приматов в разведении 1:1000.

После инкубации в течение 16 ч при о

4 С белки сорбируются на пластине лунок. Незаполненные адсорбционноактивные точки блокируют S%-ным раствором сухого обезжиренного молока, промывают и в каждую лунку вносят определенное разведение ИКА или поликлональной антисыворотки. После инку-.

Составитель N.Ñåðîâà

Редактор Н.Гунько Техред М.Дндык Корректор С.Черни

Заказ 6355/23 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 14425 бации в течение 1 ч при 37 С несвяэавшиеся антитела удаляют отмывкой и вносят разведение 1:1000 пероксидаэного антимышиного конъюгата, ино кубируют 1 ч при 37 С и отмывают несвязавшийся конъюгат. В лунки заливают раствор субстрата — орто-дианизидина, который пероксидата в присутствии перекиси водорода переводит в окрашенное соединение. Интенсивность, измеренная при 492 нм, пропорциональна количеству связавшихся с антигеном

МКА или антител поликлональной антисыворотки.

Использование MKA показывает, что уровни иммуноглобулинов в сыворотке обезьян варьируют от 65 до 105Х от таковых у человека.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных MuS musculus Ь. ВСКК (П) У 919 используемый для получения моноклональных антител к % -цепям иммуноглобулинов человека и обезьян °