Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к мyсовастеriuм воvis (bcg)

 

Изобретение относится к биотехнологии н может быть использовано , для диагностики туберкулеза. Целью, изобретения является получение штамме гибридных культивируемых клеток животных MUS mosculus, продуцирукщёго моноклональные антитела (МКА), специфически взаимодействующие с микробактериями вакционного штамма БЦЖ. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей лииии BALB/c, иммунизированных авирулентным штаммом с клетками миеломы Pj 01, Через 3-4 дня культивирования концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 40-50 мкг/мл, в асцнтической - J-8 мг/мл. МКА относятся к классу IgG, они специфически взаимодействуют с микробактериями бычьего вида БЦЖ (и слабее с Bovinue 8), 1 табл.

СОЮЗ GOBETCHHX

COUHAJlHCTI+IECHHX

PEPYS JlHH (51) 5 С 12 N 5/00, А 61 К 39/40

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

S ASXOrWOvv es paxeascxsv

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (46) 30.09.90.Бюл. У 36 (2)) 4236683/28-О (22) 28,04.87 (71) Московский научно-исследовательский институт туберкулеза, Институт . экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра AMH CCCP и Всесоюзный научно» исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (72) М.В.Андросова, И.Н .Трахт, М.А.Владимирский,, Л.М.Ходун, Л.А.Ильиных и Л.В.Погуляева (53) 578 ° 085.23(088.8) (56) P.Minden et.à1 . Infect.Immynity, )984, v.46, В 2, р. 519-525. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

KJIETOK ЖИВОТНЫХ MUS МОЯСШ 0$, HCIIOJIbЗУЕМЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЦХ

АНТИТЕЛ К ИУСОВАСТЕКЕЦМ BOVIS (BCG) (57) Изобретение относится к биотех-.

„.Я0.„1445383 А I нологии и может быть использовано, для диагностики туберкулеза. Целью, изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus пщасц1иа, продуцирующего моноклональные антитела (МКА), специфически взаимодействующие с микробактериями вакционного штамма БЦ1К.

Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей линии ВА1 В/с, иммунизированных авирулентным штаммом

-Н Ка,с клетками миеломы Р> 01 °

Через 3-4 дня культивирования концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 40-50 мкг/мл, в асцнтической - «7-8 мг/мл. МКА относятся к классу IgG они специфически взаимо" действуют с микробактериями бычьего вида БЦЖ (и слабее с Sovinue 8).

1 табл, 1445183

Изобретение относится к бйотехнблогии и может быть использовано для диагностики туберкулеза.

Целью изобретения является получе», 5 иие штамма гибридных культивируемых клеток животных Миз пявси1из, продуцирующего моноклональные антитела (NKA) специфически взаимодействую щие с мнкробактериями вакцинного штам 10 ма 85K.

Штамм получают. следующим образом.

Ичшей линии BALB/c иммунизируют авирулентным штаммом микобактерий туберкулеза Н Ra. 4 инъекции по 15 .0,2 мг полувлажной массы .подкожно в

1 течение 5 мес. Через 48 ч пос.ле трех ежедневных внутрибрюшинных бустинъекций по 0,2 мг белка сониката (надосадок разрушенных ультряэвуко- 2р . вой обработкой микробактерий) Ну Ra и БЦЖ в равном соотношении берут селеэеночные клетки для проведения гибридизации, Слияние селеэеночных кле- ток и клеток, мышиной миеломы Р- 01 проводят в соотношении 5:l с помощью .50/ полизтиленгликолп (мол,м,3500).

Клеточную смесь разливают в 96-луночные пластины по 2.10 спленоци5 тов на лунку, Для культивирования и 30 селекции гибридов используют среду

RPN1-1640 с добавлением 10Х лошадиной сыворотки,- 10Х телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гиноксантина, 4 10 И гипоксянтина, 4 ° 10 М яминоптерина и 1,6 10 М тимндина. — 5

Культуральную жидкость гибридных кле" ток проверяют на содержание антител, специфически связывающихся с антигеном микобактерий человеческого ви- 40 да Н Ку и бычьего вида — БЦЖ (надосядок разрушенных ультразвуком м псобактерий) в твердофаэной радио" иммунной реакции.

Отобранный из 500 гибридных клонов 45 клон 2А5 продуцирует в культуральную среду антитела, связывяющиеся в радиоимунной и иммуноферментной реакциях с антигенями микобактерий бычье го вида (штамма БЦЖ и в меньшей сте50 пени - музейного штамма Bovinus-87;

Лнтигены микобактерий различных ви" дов и штаммов получают путем ультразвукового разрушения .бактериальных клеток с последующим их центрифу - и" рованием при 5000 g и используют су"" пернатант в качестве янтигена (соникат) . Клетки клоня 2А5 дважды клонируют методом предельных разведений

t ло 2 клетки в лунку, содержащую в

1 качестве подложки 4 10 клеток селезенки, После второго клонирования число позитивных клонов 99Х. Продук-. ция антител сохраняется в течение

8 пассажей в культуре клеток. Часть гибридомных клеток 2А5 эамораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 1ОХ ДМСО в жидком азоте для хранения. Другую часть используют для получения гибридной опухоли в асцитной форме у мышей BALB/ñ введением внутрибрюшинно 10 клеток мы7 шям, подготовленным внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл ваэелинового масла эа 3-30 дней до инъекции клеток, Асцит образуется через 10-16 дней. Из асцнтической жидкости выделяют иммуноглобулины с помощью сульфата аммония, Штамм 2А5 хранится в Специализированной коллекции перевиваемьпс соматических клеток позвоночных Института цитологии AH СССР по номером

60D и характеризуется следующими признаками, Культуряльные признаки, Среда RPNI-1640 с 107. телячьей эмб- . риональной сыворотки и .10Х лошадиной сыворотки, 4 мМ Ь-глутамина,100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мИ пирувата натрия, аминокислотами для базальной среды ИГПа, витаминами для среды Игла, 0,05 мИ меркаптоэтанола, при 37 С в атмосфер ре 57.-ной углекислоть1.

Для выращивания штамма используют пластиковую посуду. Посевная доза

100 тыс.клеток/мл, Клетки пяссируют

1 раз в 3-4 дня, кратность рассева

1:10. Культура суспенэионная.

Культивирование в организме животных.

Для выращивания опухоли пригодны мыши ВАЬВ/с. Свежим мьш ям эа 330 дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 ваэелинового масла. Штамм инъецируют внутрибрюшинно по 10 клеток в .1 мл среды Игла. Асцит образуется через 10-16 дней.

Штамм не перевивяли.

Продуктивность штамма °

Через 3-4 дня концентрация антител в культуральной жидкости составляет

49-50 мкг/мл, в асцитической — 78 мг/мл. Стабильная секреция продукта сохраняется до 8 пассажей in

vitro.

1445183 нию субстрата (К О } в присутствии хромогена - оргофенилендиамина; Положительная реакция проявляется коричневым окрашяваиием и количественно учитывается с помощью сканирующего спектрофотометра прн длине волны

490 нм, Результаты исследований представлены в таблице.

Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к классу IgG, они специфически реагируют с антигенами микробактерий быЧьего вида штаммов

bovinus-8 и БЦЖ, Контаминация бактериями, грибами, микоплазмой не об-: наружена.

Криоконсервированне: 0,7- 1 10 клеток штамма консервировали в 1 мл телячьей эмбиональной сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание проводили в программном эамораживателе по следуюшей программе: температу- 15 о о ру снижали по 4 С в минуту до 4 С и

-по 1 С в минуту до -40 С.. Клетки хранят в жидком азоте. Размораживание: о быстро при 37 С, Жизнеспособность после размораживания по включению трипа-.20 нового синего 80-90%.

П р и и е р. На полистироловую

96-луночную панель-для микротитрования сорбируют убитые гамма-облучением микобактерии — 100 мкг культуры 25 на ячейку в 200 мкл карбонатно-бикарбонатного буфера (0,02 N, рН 9,6), о при 37 С в течение ночи ° После насыщения панели 10%-ным раствором яичного белка в фосфатно-соленом буфе- 30 ре (0,02 М, рН 7,4) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком в ячейки панели вносят

200 мкл культуральной среды штамма

2А5 на 1 ч, после чего панель трижды отмывают водопроводной водой, а потом водой с 0,05% твина-20 (процедуру отмывки повторяют трижды), вносят конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалентно свя- 4р о занных с пероксидазой (l: J 600, 37 С, l ч). После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным выше сяособом, а связавшуюся пероксидазу, а значит и анти- 45 тела против микобактерий БЦЖ, определяют количественно по расшеплеШтамм микробак- Показатель оптичестерий кой плотностя

Н 1ку (человеческий вид) О, 0510, 03

2, О

0 9520,01

БЦЖ

Bovinits-8

"Дикие штаммы

ls 65

У 77

У 2)2

9 "14

0,05+0,0j

Р 58

У 213

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что полученные МКА специфически реагируют с микобактериями туберкулеза dbtчьего вида - БЦЖ (и слабее с Bovinu s«8) °

Формула изоб ретенял

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П) N 60D, используемый для получения моноклональных антител к Мусбbacterium bovis (BCG).

Составитель М,Серова

Техред М.Ходанич Корректор М.Пожо

Редак тор Т. К люк ина

Тираж 502 - . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Заказ 3334

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4