Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к гемагглютинину вируса гриппа а /краснодар/ 101/59(н @ n @ )
Изобретение относится к биотехйологии и может быть использовано для диагностики гриппа. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцируище го Моноклональные антитела (МКА) к гемагглютинину вируса гриппа типа А. Штамм получают гибридизацией спленоцйтов мьшей линии BALB/c, иммунизированных вирусом гриппа А(Краснодар) Т01/59 (H2N2), с клетками миеломы NSO. МКА относятся к классу (К). Они специфически взаимодействуют с гемагглютинином вирусов гриппа типа А в реакциях непрямой иммуно флюоресценции, торможения|.гемагглютинации, нейтрализации на куриных змбрионах. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении 70 пассажей in vitro и 5 пассажей, на мышах линии BALB/C. 3 табл. i (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 N 5/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4242747/28-13 (22) 11.05.87 (46) 23.12.88. Бюл. Ф 47 (71) Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов (72) Ф.Г.Нагиева, О.Н.Агеева, В.Г.Никулина, Г.В.Эткинд,,Е.И.Кузнецова, И.В.Кусельтан и О.Г.Анджапаридзе (53) 578.085.23 (088.8) (56) Ионоклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа. — M. Медицина 1983, с. 323-341. (54) 11ITAMM ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК ЖИВОТНЪ|Х MUS KJSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА
ГРИППА А(КРАСНОДАР) 101/59 (82N2) (57) Изобретение относится к биотех„„SU„„1446156 А1 йологии и может быть использовано для диагностики гриппа. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных «Aus musculus, продуцируницего моноклональные антитела (МКА) к гемагглютинину вируса гриппа типа А.
Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьппей линии BALB/с, иммунизированных вирусом гриппа А(Краснодар)
101/59 (H2N2), с клетками миеломы
VS0. ИКА относятся к классу JgG.,„ (К). Они специфически взаимодействуют с гемагглютинином вирусов гриппа, типа А в реакциях непрямой иммуно флюоресценции, торможения гемагглюти: нации, нейтрализации на куриных эмбрионах. Стабильная продукция NKA сохраняется на протяжении 70 пассажей in vitro и 5 пассажей. на мьппах линии BAL3/С. 3 табл.
1446156
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики гриппа.
Целью изобретения является полу5 чение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musclus, продуцирующего маноклональные антитела (МКА) к гемагглютинину вируса гриппа типа А. I0
Штамм получают следующим образом.
Для иммунизации используют шестинедельных самок мышей линии BALB/с.
Схема иммунизации животного включает внутрибрюшинное введение концентри-1g рованного и очищенного вируса гриппа А(Краснодар) 101/59 (H2N2). Доза вируса составляет 100 1ОЗ ГАЕ на мышь в объеме 0,5 мл в полном адьюванте Фрейнда. Через две недели вво- 20 дят антиген в той же дозе в полном адъюванте Фрейнда. За три дня до слия нйя внутривенно вводят О, 1 мп антигена в солевом буферном растворе в дозе 50>10з AE на мышь.
В качестве злокачественного партнера применяют мышиную миеломную линию NSO. Клетки NSO выращивают в стационарных условиях в пластиковых
300 мп матрицах. За неделю до слия- 30 ния их поддерживают в фазе логарифмического роста путем ежесуточного пересева в новые матрицы с индексом
1:2-1:3. Ииеломиые клетки выращивают в ростовой среде следующего соста-35 ва: среда RPMI-1640 или ДИЕИ с 0,13Х
МаНСО, глюкозой до 4 г/л, 5Х сыворотки эмбрионов коров и 5Х сыворотки суягных овец, очищенной полиэтиленгликолем, пируват натрия 0,05 40 мг/мл, оксалоацетат 0,15 мг/мл, инсулин 0,2 ед/мл, 2-меркаптоэтанол
5 -10 М, HEPES 5-10 mM гентамицин
50 мкг/мл.
Иммунные спленоциты получают на 45 третий день после бустерной внутривенной инъекции антигена мышам из стерильно извлеченных селезенок.
Спленоциты извлекают путем многократного введения в пульпу селезенки О
О, 1-0,2 мл холодной ростовой среды
RPVI-1640 или ДИЕТ с помощью тонкой иглы со шприцем.
Извлеченные спленоциты собирают в пластиковые охлажденные пробирки, осаждают центрифугированием при
1000 об/мин в течение 10 мин, осадок клеток с эритроцитами обрабатывают в течение 5 мин на холоду
0,33Х-ным раствором NH<01 в 5-кратном объеме. После лизиса эритроцнтов клетки потворно осаждают и дважды промывают в бессывороточной среде RPMI-1640 или ДИЕМ. Для слияния используют 5ОХ-ный раствор полиэтиленгликоля с мол. массой 1000.
Иммунные спленоциты сливают с клетками ИБО в соотношении 5:1.
Иммунные спленоциты от двух мышей сливают с клетками NSÎ и распределяют в 20 96-луночных пластин со слоемкормилкой из неиммунных спленоцитов.
Селекцию гибридных клеток проводят в среде НАТ, составленной из ростовой среды с 10" M гипоксантина, 1,6 .10- И тимидина и 4 10 И аминоптерина.
Начиная с 3-х суток с момента культивирования и в последующие дни в лунки культуральных пластин каждый
3-4 дня вносят по 2 капли свежей селективной среды или из пластин удаляют 0,1 мл культуральной среды и заменяют на свежую. Начиная с
20 сут с момента культивирования клетки из лунок, в которых наблюдается рост гибридных клеток, пересевают в 24-луночные пластины со слоем— кормилкой из неиммунных спленоцитов.
Неиммунные спленоциты ресуспендируют в среде НТ (селективная среда без аминоптерина) и по О, 1 мл распределяют в 24-луночные пластины (спленоциты, полученные от одной мыши, распределяют на две 24-луночные пластины) °
Клоны гибридных клеток, растущие в
24-луночных пластинах со слоем— кормилкой, выращивают до формирова" ния сплошного слоя, а затем клетки пересенают в 24-луночные пластины без слоя — кормилки. Через 10-14 дней проводят замену гибридомной среды с высоким содержанием сыворотки на среду со сниженной концентрацией сыворотки (2-4X).
Скрининг супернатантов из растущих гибридных культур проводят с помощью твердофазного варианта иммуноферментного анализа (ИФА). Антигены вирусов гриппа А для ИФА готовят путем инфицирования клеток почки собак (линия МДСК). Б качестве контрольного антигена служат аналогичным образом приготовленные неинфицирован. ные клетки МДСК. Антителопродуцирующие клоны гибридных клеток выращивают в пластиковых флаконах площадью
3
14461
25 см со слоем — кормилкой из спле-. ноцитов и после накопления клеток в достаточном количестве (сплошное по-. крытие ростовой поверхности флакона) проводят оценку MKA в культуральных жидкостях (кж) на активность и специ< фичность. По данным проведенного исследования осуществляют выбор клонов для их накопления в массовой культу- 10 ре и криоконсервации
В результате слияния получают коллекцию гибридов с различной реактивностью к вирусу гриппа А(Краснодар)
101/59 (H2N2) .
Наиболее продуктивный штамм выводят в массовую культуру и обозна" чают Кр 3-30. Штамм Кр 3-30 хранится в Специализированной коллекции переви аемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН
СССР под номером! 889 и характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Морфология клеток гибрндомы Кр 3-30 не от- 25 личается от родительской линии. Клетки округлой формы, размножаются в суспензионном состоянии и обладают слабой адгезией к поверхности пластика или стекла.
Культуральные признаки. Среда для культивирования — RPNI-1640 или
ДМЕМ с 0,13Х Na 00g, глюкозой до
4 г/л, 5-101 сыворотки эмбрионов коров или суягных овец (очищенной полиэтиленгликолем), пируватом нат35 рия (0,05 мг/мл), оксалоацетатом (0,15 мг/мл), инсулином (0,2 ед/мл), 2-меркаптоэтанолом (5" 10 Б М), HEPESбуфером (5-10 шМ) . Температура культивирования 36,5 С.
Клетки растут в суспензии, обладают слабой адгезивной способностью к поверхности пластика или стекла. По« севная доза 200-300 -10 клеток/мл, 45 .кратность рассева 1:4-1:6, пассаж, два раза в неделю.
Культивирование гибридомы в организме животного. Самок мышей BALE/с в возрасте 2-2 5 мес сенсибилизируюй
Э, 50
,.5 мл пристава внутрибрюшинно за
=-10 дней до введения 2-4 "10 гибрид..ах. клеток, через 10-14 дней форми:.уется асцитная опухоль. Перевивае» .зсть гибридом в 100Х случаев. Qpo55 уктивность штамма. Титр МКА, выяв
::-емый с помощью иммуноферментного нализа, составляет 1-4:10 в куль туральной жидкости, 1: 10 в асцити-.
56
4 ческой жидкости (аж) . Стабильная продукция антител сохраняется на про тяжении 70 пассажей in vitro и 5 пассажей на мышах-BALB/ñ.
Характеристика полезного продукта.
МКА относятся в классу С ц(К). Они специфически взаимодействуют с гемагглютинином вируса гриппа А(Краснодар) 101/59 (H2N2).
Активность MKA в реакции непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) составляет 1:10 (кж) и 1:10 (аж), в реакции торможение гемагглютинации (РТГА) — 1: 10 (кж) и 1:5, 1 г10 (аж) в реакции нейтрализации (РН) на куриных эмбрионах (со l00 ЭИД вируса)
3, 2 10э (аж), Контаминация .. Гибридома свободна от бактериальных контаминантов и микоплазм.
Криоконсервирование. Среда для замораживания — сыворотка эмбрионов коров 90Х диметилсульфоксид 10Х.
1 мл клеточной суспензии с плотностью не ниже 2 -10Б жизнеспособных клеток, ресуспендированных в холодном криоконсерванте, переносят в пластиковые
1,8 мл ампулы, укладывают в пенопластовую коробку с толщиной стенок не менее 1,5 см и немедленно помещают на холод (-70)- (-80) С. На следующие сутки ампулы переносят в жидкий азот, Замороженные ампулы оттаивают в воде при 37-39 С. Клетки разводят в 10 раз эмбриональной сывороткой и осаждают центрифугированием при
500 об/мин в течение 10 мин. Восстановленные клетки ресуспендируют в ростовой среде концентрации 2 5 "
« .«10 — 3,0 .10 жизнеспособных клеток в 1 мл, переносят в пластиковые культуральиые флаконьi. Жизнеспособность после размораживания составляет 4060Х, устанавливаемые по дифференциальной окраске клеток с помощью 0,25Хного раствора трнпанового синего.
Пример. МКА выделяют из аж с помощью 20Х полиэтиленгликоля, мол. массы 6000 и приготавливают на их основе иммуноферментный конъюгат (соотношение белка и перексидазы 2:
:1), иммунофлюоресцентный коньюгат (соотношение красителя ФИТЦ и белка
1:50) и эритроцитарный антительный диагностикум для реакции обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА), Результаты исследования полученных диагностических препаратов с .анТаблица 1
Вирус гриппа А (Н21 7
Паказате и при разведении пероксидазнаго конью,".HTB на основе манаклональных антите -: (абратные величины) 4О
1 1000 200(. 00 8000 10000
+4 +-4 -+4 +3 +
Краснодар (101) 59
Ленинград (i34) 57
Ленинград (549) 80
+4
Контроль А/PR/8 (34/HINI) Вирус кори (Л-16) ед, " — ", — отсутствие
П р и м е ч а н и е. +4, .+3 + - активность И6Л усп. реакции.
Разведения ФИТЦ - каньюгата (обратные величи- . ны) Вирус гриппа А (Н2Й ) 128 256
Краснодар (101) 59
Ленинград (134) 57
Ленинград (549) 30
Контроль: A/PR/ß/34 (81N1) Вирус кори (Л-1. )
Клетки ИДСК
П р и м е ч а:. и е. +4 — свечение 100% клеток в ноле зрения; +3 -- све чение,75% клеток в поле зрения; — — отсу.с вне свечения. тигенами вирусов гриппа представлены в табл. 1-3, Результаты, приведенные в табл.
1-3, свидетельствуют с высокой акть ", ности и специфичности полученных диагностических препаратов. При этом
MKA узнают общий эпитоп на гемагглютинине вирусов гриппа типа .A(H
1Лтамм гибридных культивируемых клех:ок животных Mus muscu1us ВСКК (П1
M 88 0, используемый для получения манокланальных антител к гемагглютинину вируса гриппа А(Краснодар)
101/59 (H2N2), ) 4461 56
Габлица3
"Гашение РОПГА антнсыворотками (титры антигенов, обрат ные величины) Исследуемый материал полипотентной моноклональной гомогомологич" ной логич ной
Вирус гриппа А (Краснодар) 101
512
512 32
0 0
Вирус кори
Составитель М. Серова
Техред Л. Олийнык
Корректор М.Максимишинеп
Редактор Н.Гунько
Тираж 520 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Заказ 6706/30
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Титр антигена в
РОПГА (обратная величина) полипот ентной гетерологичной
