Способ получения растений-регенерантов кукурузы из культуры тканей

 

Изобретение относится к биотехиологии, а именно к культивированию тканей растений, и может быть использовано в селекционной работе. Целью изобретения являет.ся увеличение выхода растений-регенерантрв из культуры тканей, а также повыпение их жизнеспособности, что достигается добавлением в среду для регенерации, и в среду для укрепления побегов предшественников мтогормонов - триптофана и аденина. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (}1) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ САГИД.:ТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4242380/31-13 (22) 02.04.87 (46) 23.12.88. Бюл. Ф 47 . (71) Институт молекулярной биологии и биохимии AH КазССР (72) Л.Р, Сайб и М.К. Карабаев (53) 578.085.23(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕHEPAliT0B КУКУРУЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ (57) Изобретение относится к биотех(д) 4 С 12 N 5/00 А 01 Н 5/10 нологии, а именно к культивированию тканей растений, и может быть использовано в селекционной работе. Целью изобретения является увеличение выхода растений"регенерантов из культуры тканей, а также повьипение их жизнеспособности, что достигается добавлением в среду для регенерации, и в среду для укрепления побегов предшественников фитогормонов — трипто4ана и аденина. б табл.

1446155

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры изолиро5 ванных тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и линий кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками., f0

Низкий выход регенерантов растений в культуре тканей злаковых явля-., ется одним из лимитирующих факторов для применения клеточных технологий в процессах создания новых сортов растений с хозяйственно ценными признаками..

Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и увеличение их жизнеспособности.

Способ заключается в том, что при культивировании растений кукурузы в культуре тканей, включающем. культивирование эксплантатов на питательной среде, субкультивирование 25 первичных каллусов, отбор морфогенных каллусов и получение в дальнейшем растений-регенерантов,в среду для регенерации растений и в среду для укрепления сформировавшихся побегов добавляют предшественники фитогормонов — триптофан (предшественник ауксина) и аденин (предшественник цитокинина) в определенном соотношении. При этом наличие в сре35 де предшественников фитогормонов позволяет смещать направленность синтеза эндогенных фитогормонов и дает возможнос ть более тонко регулировать морфогенетические процессы в каллусах сообразно физиологическим особенностям каждого генотипа.

Способ осуществляется следующим способом.

Незрелые зародыши (15-20 дн после опыления) гибридов кукурузы поверхностно стерилизуют в 2%-ном растворе хлорамина в течение 20 мин, трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду N6

Чу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% arapa, 1 мл/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), цптком вверх и культивируют при 32+

+1 C в темноте в течение 2-3 недель.

Образовавшиеся каллусы пассируют на свежую питательную среду .каждый 2-3 недели, Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогенные двух типов: желтые, плотные, развивающиеся иэ зародышевой оси, или белые, блестящие, плотные, развивающиеся из тканей щитка.

Отобранные каллусы переносят на среду регенерации N6, содержащую

1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1Х агара, 40-60 мг/л триптофана, 1-9 мг/л аденина, 0,1-0,3 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27+1 С при

16-часовом фотопериоде.

Через 1-2 недели образовавшиеся побеги переносят на среду N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 10-30 мг/л триптофана и

1-20 мг/л аденина, для укрепления сформировавшихся побегов и культивируют при 16-часовом фотоперцоде при

27+1 С.

Через неделю укрепившиеся побеги высаживают на среду для укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по N6 и 1% сахарозы, 1% araра, и выдерживают на ней в течение недели при 27+1 С и 16-часовом фото- . периоде. Укоренившиеся побеги пересаживают в почву и культивируют до стадии зрелости.

Получение морфогенных каллусов кукурузы (общее для всех случаев).

Незрелые зародьппи 15-20 дн после опыления гибридов кукурузы Днепровский 247, P-927, н.5166 и инбредной линии 0,5445 поверхностно стерилизуют в 2%-ном растворе хлорамина в течение 20 мин, трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду Ntj Чу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахароэы, 1% агара, 1 мг/л 2,4-Д, щитком вверх и культивируют при 3221 С в темноте в течение 2-3 недель. Образовавшиеся каллусы пассируют на свежую питательную среду каждые 2-3 недели.

Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогениые двух типов: желтые., плотные, развивающиеся из тканей зародышевой оси, или белые, блестящие, плотные, раэвивакщиеся из тканей щитка. Отобранные каллусы переносят на среду регенерации.

Пример 1. Полученные морфогенные каллусы пересаживают на среду регенерации N6 содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1Х агара, 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина, 3

144

0,1 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27 1 С при 16-часовом фотопериоде.

Через 1-2 недели формируются листовые зачатки, побеги на некоторых морфогенных каллусах. Частота образования регенерантов зависит от генотипа исходного растения.

Процент регенерации растений для различных генотипов кукурузы на среде Мб с 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина, 0,1 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 1.

Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 40 мг/л, триптофана, 1 мг/л аденина и 0,1 мг/л

2,4-Д (нижняя граница заявленного интервала концентраций компонентов).

Пример 2. Морфогенные каллусы пересаживают на среду М6, со" держащую мг/л тиамина, З сахарозы, 1 агара, 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина 0,2 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27+! С при 16-часовом фотопериоде.

Через 1-2 недели наблюдается формирование зачатков побегов, причем со .значительно большей частотой, чем на среде регенерации (пример I).

Частота регенерационных событий так.же зависит от генотипа растений доноров эксплантатов.

Процент регенерации растений для различных генотипов иа среде М6 с

50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и 0,2 мг/л 2,4-Д приведен в табл.2.

Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина, 0,2 мг/л 2,4-Д наилучшим образом, с наивысшей частотой регенерации (оптимальные концентрации компонентов).

Hp и м е р 3. Морфогенные калпусы пересаживают на среду регенерации

М6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 60 мг/л триптофана, 9 мг/л аденина и 0,3 мг/л

2,4-Д, и культивируют на свету при

27+! С и 16-часовом фотопериоде.

Частота формирования зачатков побегов, образующихся через 1-2 недели, снижается для всех тестированных генотипов по сравнению с вариантом с оптимальными. значениями концентраций компонентов. Осуществление способа

4 получения растений-регенерантов из каллусов возможно при концентрации в среде регенерации N6 триптофана

60 мг/л, аденина 9 мг/л, 2,4-Д

0,3 мг/л (верхняя граница заявленного интервала концентраций компонентов).

Процент регенерации растений для различных генотипов на среде М6 с

60 мг/л триптофана, 9 мг/л аденина и 0,3 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 3.

Пример 4. Изучают влияние

Ф различных концентраций триптофана и !

5 аденина на регенерацию растений в культуре каллусов. Концентрацию триптофана в среде М6 меняют от 20 до

80 мг/л, аденина от О до 10 мг/л, концентрация 2,4-Д фиксируется на

20 уровне 0 2 мг/л. !

При этом показано (табл. 4), что использование триптофана в концентрации ниже 40 мг/л и выше 60 мг/л, 25 аденина киже 1 мг/л и выше 9 мг/л не приводит к желаемому эффекту— регенерации растений.

Данные сведены в табл. 4.

П р и и е р 5. Зачатки побегов, сформировавшихся на среде регене-. рации, переносят на среду М6 для укрепления гобегов, содержащую 1 мг/л тиамина, З сахарозы, 1 агара, 10-30 мг/л триптофана, 1-20 мг/л аденина и культивируют на свету при

l6-часовом фотопериоде при 2711 С.

При использовании среды для укрепления побегов с добавлением триптофана и аденина в укаэанных интервалах концентраций наблюдается более быстрый рост растений, увеличивается их высота и диаметр,и, таким образом, повышается жизнеспособность регене45 Р

Влияние триптофана и аденина в среде для укрепления побегов на жизнеспособность растений-регенерантов, показано в табл, 5.

Пример 6. Изучают влияние различных концентраций триптофана и аденина в среде для укрепления побегов на увеличение жизнеспособности регенерантов. Уровни триптофана меняют от О до 40 мг/л, уровни аденина — от О до 30 мг/л.

Результаты исследований приведены в табл. 6.

5 144615

Из табл. 6 видно, что при исполь- зовании концентраций триптофана выше 30 мг/л и аденина выше 20 мг/л наблюдается некоторое угнетение рос5 та побегов. При концентрациях триЯтофана ниже 1О мг/л и аденина ниже

1 мг/л нет заметного увеличения жизнеспособности регенерантов.

Через неделю культивирования на среде для укрепления побегов регенеранты пересаживают на среду для укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по N6, 17. сахарозы, 1X arapa, и выдерживают на ней в течение недели при 27 1 С и 16-часовом фотопериоде. Укоренившиеся побеги .переносят в почву и культивируют до стадии зрелости.

Генотип

Побегообразование, 7

Гибриды

Днепровский

247

15,1

P-927 н 5166

4,2

3,5

Инбредная линия 05445

1,0

Таблица2

Генотип

Побегообразование, 7

20 Гиб риды

Формула изобретения

58,3

Днепровский 247

P-927

Способ получения растений-регенерантов кукурузы из культуры тканей, включающий культивирование первичных эксплантатов на питательной среде

N6 Чу Вонга, субкультивирование первичных каллусов, отбор морфогенных каллусов и получение из них регенерантов, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода растений-регенерантов и увеличения их жизнеспособности, в питательную среду для регенерации добавляют триптофан B концентрации 40-60 мг/л, аденин в концентрации 1-9 мг/л и

2,4-Д в концентрации 0,1-0,3 мг/л, а в среду для укрепления побегов добавляют. триптофан в концентрации

10-30 мг/л и аденин в концентрации

1-20 мг/л.

12,3

25 н5166

10.„5

Инбредная линия

05445

5,2

Таблица 3

Гибриды

Днепровский 247

P-927

9,3

2,2 н5166

Инбредная линия

40 05445

1 5

Таблица 4

Компоненты среды, мг /л

Регенерация, Ж для генотипа гТрипто- 05445 н5166 P-927 ДнепровсАденин фан кий 247

О

О

О

20

1О

0 0

50

50!

0,5 12,3 58,3

1446155

Продолжение табл.4

Компоненты среды, мг/л егенерация, и для генотипов

5445.ТриптоАденин

Фан н5166 P-927

Днепровский 247

l0

80

Таблица 5

Компоненты среды, Иощнос ть поб era

Гибрид мг/л

Диаметр, Высота, Триптофан Аденин мм см

Днепровский 247 Без добавок

0 5-1

30

P-927

Без добавок

20

20 1,2-2,5

I

Таблица 6

Компо не н ты ср еды, мг/л

Мощность побега

Диаметр, мм

Триптофаи Адении

Высота, см

Без добавок

0,5-1, 0

1-1,5

10 0,0-1 0 1,0-1,6

1,2-1 7

1,0-1,5

1 1,0-1,5

10 2,0-3,0

20 1,5-2,0

0,4-0, 9

1 0,8-1, 5

10 1,5-3,0

l 0-1 5

l,2-1,7

2,5-3,5

198=2 0

О, 8-1,0

li3-li8

2,0" 3,0

1,5-2,5

1446155 10

Продолжение табл.б

Компоненты среды, мг/л а

Мощность побега

Высота, см

Диаметр, Триптофан Аденин

2,5-3,5

30

1 „Ы-2,6

30

10

О, 4-0, 8

40

О, 3-0,8

Составитель В. Демкин

Редактор Н. Гунько Техред М.Моргентал Корректор Г. Решетник

Заказ 7566

Тираж 520

Подписное

ВНИИХИ Го.ударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

2,0-3,0

1,5-2,0

0,6-1,1

1,2-1,5

1, 1-1,3

1в0 1ь4