Способ оценки кинетики клеточных популяций in viтrо
Изобретение относится к биологии , в частности к изучению культивируемых клеточных культур. Целью изобретения явдяется упрощение способа и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям. Изобретение позволяет получить оценки продолжительности премитотической и синтетической фазы митотического цикла и распределения клеток популяции по этим фазам. Оценки получают при исследовании клеточной культуры, выращиваемой в одной матрице, Монослойно культивируемые клетки импульсно инкубируют с радио-, активным предшественником ДНК. Культур альный матрац помещают в аппарат фракционирования и соединяют трубками с питательной средой, с коллектором фракций (КФ) и с коллектором клеток для инкубации с флуоресцентньм красителем (КК). Клетки вступившие в митоз, фракционируют из популяции периодическим встряхиванием . Каждьй раз часть получаемой фракции перекачивают в КФ и.осаявдают на фильтры для последующего определения радиоактивности. Вторую половину сливают в КК, окрашивают и прокачивают через камеру для проточного счета люминесцентного микроскопа . В матрац закачивают свежую питательную среду и через определенное время повторяют всю процедуру. По отношению радиоактивности каждой фракции к количеству клеток этой фракции определяют интенсивность синтеза ДНК (ИС). В результате по НС и времени получения фракций определяют продолжительность синтетической фазы, а затем продолжительность премитотической фазы. По количеству клеток во фракциях, полученных за время каждой фазы, оценивают распределение клеток популяции. 2 ил., 4 табл. сл О5 4
СВОЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
А1
„„SU„„ l4S» (SD 4 С 12 N 15/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
Н ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4112462/28-13 (22) 18. 08. 86 (46) 15.01.89. Бюл. У 2 (71) Сибирский филиал Всесоюзного научного центра психического здоровья AMH СССР (72) Е.А.Гуткевич (53) 976.35 (088.8) (56) Quastler А., Sherman Т.С.
Cell population kinetics in the intestinal epithelium of the mouse.
17.420-439, 1959. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ КИНЕТИКИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ IN VITRO (57) Изобретение относится к биологии, в частности к изучению культивируемых клеточных культур. Целью изобретения является упрощение способа и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям. Изобретение позволяет получить оценки продолжительности премитотической и синтетической фазы митотического цикла и распределения . клеток популяции по этим фазам. Оценки получают при исследовании клеточной культуры, выращиваемой в одной матрице. Монослойно культивируемые клетки импульсно инкубируют с радиоактивным предшественником ДНК. Культуральный матрац помещают в аппарат фракционирования и соединяют трубками с питательной средой, с коллектором фракций (КФ) и с коллектором клеток для инкубации с флуоресцентным красителем (КК). Клетки, вступившие в митоз, фракционируют из популяции периодическим встряхиванием, Каждый раэ часть получаемой фракции перекачивают в КФ и осаждают на фильтры для последующего определения радиоактивности. Вторую половину сливают в КК, окрашивают и прокачивают через камеру для проточного счета люминесцентного микроскопа. В матрац закачивают свежую питательную среду и через определенное время повторяют всю процедуру. По отношению радиоактивности каждой фракции к количеству клеток этой фракции определяют интенсивность синтеза ДНК (ИС). В результате по ИС и времени получения фракций определяют продолжительность синтетической фазы, а затем продолжительность премитотической фазы. По количеству. клеток во фракциях, полученных эа время каждой фазы, оценивают распре- деление клеток популяции. 2 нл., 4 табл.
1451164
Изобретение относится к биологии, в частности к изучению культивируемых клеточных культур.
Цель изобретения — упрощение спо5 соба и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям, Увеличение информативности и уп- 10 рощения способа достигается за счет того, что исследуемую клеточную популяцию периодически фракционируют, извлекая в результате встряхивания нитотические клетки в виде фракций, 15 в которых определяют концентрацию клеток и их радиоактивность, по результатам этих измерений строят кривые изменения количества клеток и удельной радиоактивности от времени, 20 по которым определяют продолжительность пренитотической Г, синтетической S и пресинтетической Г, стадий клеточного цикла, распределение клеток ростовой фракции по этим стадиям 25 и распределение клеток,на протяжении этих стадий.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Используют две культуры фибробластоподобных клеток линий ФЭЧ-Л22 и ЧЭЧ-Л23. Клетки субкультивируют на протяжении 2 пассажей. Пересев клеток осуществляют стан- . ,дартным способом, с использованием стандартных питательных сред. В экспериментальные матрицы засевают
3,4 10 клеток/матрац. Взяты 1 матрац с культурой ФЭЧ-Л22 и 1 матрац с культурой ФЭЧ-Л23. Этап предфракционного культивирования составляет 23 ч. 3а г
1 ч до начала фракционирования питательную среду в экспериментальных флаконах заменяют на среду того же состава, содержащую Н-тимидин (5 мКи/мл). Культуры клеток инкубируо ют в этой среде 60 мин при 37 С, отмывают от невключившегося предшественника ДНК тремя объемами свежей питательной среды и вновь добавляют 45 мл
50 питательной среды. В качестве среды для фракционирования используют среду стандартного состава. Этап фракционирования проводят по одночасовому циклу. Режим культивирования составляет 50 мин, режим фракционирования
10 мин. За время эксперимента было собрано 29 фракций клеток.
Результаты приведены в табл.1 и 2.
На фиг.1 и 2 представлены М- и
S-профили культур ФЭЧ-Л23 ФЭЧ-Л22 соответственно.
Результаты расчетов промежуточных величин для оценки параметров продолжительности стадий клеточного цикла приведены в табл.3 и обозначены стрелками на фиг.1 и 2. Данные для оценки параметров распределения клеток ростовой фракции по стадиям клеточного цикла и для определения распределения клеток культуры в каждой стадии цикла представлены в табл.1 и 2 (столбец 9).
Значения кинетических параметров для исследуемых культур приведены в табл.4.
Пример 2. Вычисление исходных величин.
Исходными данными для расчета кинетических параметров являются характеристики митотического профиля (М-профиля), представляющего собой кривую, описывающую изменение количества клеток популяции, вступающих в митоэ в зависимости от времени получения фракции, и S-профиля, который описывает изменение интенсивности включения радиоактивного предшественника ДНК (удельной радиоактивности) от времени получения фракции. В табл.1 приведены данные для построения М- и $-профилей. Для выполнения расчетов параметров продолжительности стадий клеточного цикла количественный выход клеток и данные удельной радиоактивности преобразовывают по методу скользящего среднего. Кривые М- и S-профиля строят по данным, приведенным в столбцах 7 и 8 (табл.1) °
Процедура оценки кинетических параметров (фиг.1) заключается в следующем.
Из кривой, описывающей Y-профиль, видно, что она представлена тремя пиками. Первый пик имеет максимум в точке "2 ч" и минимум в точке, соответствующей "3 ч" фракционирования. Второй пик имеет максимум, приходящийся на "5 ч" и два минимума в точках "3" и "10 ч". Третий пик имеет максимум в точке "16 ч" и два минимума в точках "10" и "22 ч".
Кривая S-профкля представлена двумя пиками, которые описываются
1451164 максимумами в точке "8 z " и минимумами в точках "2" и "16 ч" и максимумом в точке "26 ч" с соответствующими минимума в точках "16" и
"29 ч". Для вычисления параметров
Т, Т и Тс необходимо определить начало и окончание выхода клеток, находящихся в С, S и С, периодах клеточного цикла (что соответствует пер- 10 вому, второму и третьему пикам митотического профиля). Для определения интервалов времени, соответствующих вхождению в митоз Gz S и С» субпопуляций клеток, кривые М- и S-про- 15 филей аппроксимировали кусочно-линейными функциями. В общем виде эта процедура состоит в описании каждого пика М- и S-профилей двумя линейными функциями: 20 (1) (2) у = 100,5 t — 183,3. (3)
Нисходящая часть пика приходится на 5-10 ч фракционирования и описывается следующим выражением (на основе уравнения 2 и упомянутого примера): у = -62,8 с + 611,1, (4) ! где t — начало выхода клеток S стадии клеточного цикла в ми25 где P — коэффициент регрессии, характеризующий восходящую часть пика;
I — время, в течение которого переменная у увеличивается, . ! — коэффициент регрессии, характеризующий нисходящую часть пика;
t " время, в течение которого
I( переменная у уменьшается.
I (!
Приравнивая значения у и у нулю, находим точки начала и окончания пика. На фиг.1 рассмотрим второй пик кривой М-профиля (интервал между 3 и 10 часами фракционирования}. Восходящая часть пика начинается в точке, соответствующей 3 ч и продолжается в течение двух последующих часов, описывается выражением, которое является преобразованием уравнения (1) по данным примера (табл.1, столбец 7, 3-5 фракции): тоэ, определяемое по М-профилю, (l — окончание выхода клеток S5 стадии клеточного цикла в митоэ, определяемое по Мпрофилю. Пр фавнивая у и
11 у к нулю получаем оценки и
183 3
1,82 ч
100,5 (5) -611 1
= — — - = 9,73 ч.
-62,8 (6) I И д + с(ю
Т т
2 (7) т, = т," —, (8) Il где Т вЂ” окончание G стадии.
В ряде случаев t не определяют, 6 т.е. первый пик М-профиля имеет
Подобным образом вычисляются и другие промежуточные величины, необходимые для определения продолжительности (тд, Т5, Т 1) стадий клеточI ного цикла. Ниже указаны условные обозначения и определения этих величин М-профиль:
t — начало выхода клеток G< стадии в митоэ» — окончание выхода клеток Gq и
6а стадйи в митоэ, 1
t< — начало выхода клеток Gr
1 стадии в митоз; ! ( — окончание выхода клеток С, ( стадии в митоз
S — профиль, — начало выхода клеток Б стадии В митоэ
11 око нч ание выхода кл ет ок S стадии в митоз," — начало выхода в митоз клеток, прошедших второй цикл.
II II(Расчеты t<,, t по 8-профилю выполняют с использованием уравнений (1) и (2). Получив оценки девяти ве((Ф (lI (tq ° с, С, Йэ
lI 1 1 „" }, определяют продолжительность периодов клеточного цикла по следующим формулам.
Пример 3 ° Оценка параметров продолжительности стадий клеточного цикла.
Продолжительность С стадии (т ).
14511
It «
« t< +
Т
10 (10) II
Т - Т, - Т, .
20! к I
И + tc
Т - l
Ъ 2 (,13) « I
Т вЂ” Т (14) Т
25 только нисходящую часть (фиг.1). В этом случае за начало С периода принимают начало фракционирования,т.е. нулевая точка.
Продолжительность $ стадии (Т ).
Т -3- — -2
+ t
5 2 (9) ! где Т5 - начало $ стадииj
Т" — окончание $ стадии.
Продолжительность G, стадии (Т ), 1
Т = - — - (12)
I где Тс — начало С, периода
Т вЂ” окончание С, стадии.
Ч1
Вычисленные значения промежуточных величин приведены в табл.3.
Оцененные параметры Тс,, Т5, Т 30 приведены в табл.4.
Пример 4. Оценка параметров, I характеризующих распределение клеток ростовой фракции по стадиям клеточного цикла (N I Nз,N )°.
Для определения количества клеток, находящихся в каждой стадии клеточного цикла, используют вычисленные выше оценки продолжительности каждой стадии клеточного цикла. Подсчет кле- 4 ток, находившихся в каждой стадии цикла, проводят путем суммирования количества клеток, полученных во фракциях за период соответствующей стадии клеточного цикла (Т, Т5, Т,). Для культуры ФЭЧ-Л22 продолжительность стадии С составила (1,16,4 ч (табл.4). Суммируя количество клеток, полученных в первых шести часовых фракциях и прибавляя клетки, полученные за 0,4 часа седьмой фракции, получим за время С стадии в митоз вошло 1465,6«10» клеток (табл.2, столбец 9). Аналогичным путем вычисляют оценки количества клеток других стадий клеточного цикла (N5 и Н,).
Таким образом, структура ростовой фракции исследуемой популяции клеток .состоит. из 34,7% N, 44,1% N5, «
64 6
13% N< и 8,2% клеток, прошедших втоЦ рой цикл.
Пример 5. Оценка параметров, отражающих распределение клеток популяции в каждой стадии клеточного цикла (Р% 1 Is у flic )
В общем виде эти параметры вычисляются по формуле для коэффициента линейной регрессии к
Q: (t.: — t) (log у; — log у )
f3 - „, (15) (t, — t) где К вЂ” номер последней фракции клеток соответствующей стадии клеточного цикла — время получения фракций клеток соответствующей стадии клеточного цикла; у. — количество клеток соответЧ ствующей стадии клеточного цикла, полученное к моменту времени
Например (табл.2, столб. 9), для культуры ФЭЧ-Л22 t, = Т 1,1 ч, = Т, = 6 4 ч. Количество клеток сz за это время увеличилось с у, 208,8 10» до у„ = 1465,6«10» клеток.
Вычисленное по формуле (15) значение
2 составляет 0,0012, Таким образом, используя предлагаемьй метод, в одном эксперименте получены три группы параметров. Эти параметры характеризуют проролжительность стадий клеточного цикла, распределение клеток популяции по этим стадиям и распределение клеток внутри каждой стадии цикла.
Формула изобретения
Способ оценки кинетики клеточных популяций in vitro путем импульсного инкубирования с радиоактивным предшественником ДНК с последующей оценкой кинетических параметров, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью. упрощения способа и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям, исследуемую клеточную популяцию периодически фракционируют, извлекая в результате встряхивания митотические клетки в виде фракций, в которых определяют концентрацию клеток и их радиоактивность, по результатам этих из1451164 тетической $ и пресинтетической С< стадий клеточного цикла, распределение клеток ростовой фракции по С, $ и С, стадиям и распределение клеток на протяжении G>, S и С стадий клеточного цикла.
Таблица 1
Время сбора, ч
Объем фракций, мл
Концентрация клеток, кл./мл х10
РадиоактивКолиУдельная раНакопКоличество кл./фр,, кл. «10
Удельная радиоактивность срт/кл. 10 чество кле/фр кл. 10 ление, кл. «10 диоактивность срт./кл.
«10 ность фракции срт./ил
6,0 715,5 0,38
15,9
5,96 74 65,6 12,4
793,2
2,16111,0 9,45
63,4
12,5 6,04
64 75,5
10,5
5,46
131 192
8 24
4,25 570,9
2,3
312
5,0
156 312
31,2
938,9
1004, 9
1032,9
33,4
187
5,6
66
14,8
6,0
29,5
2,24 66
2,32 56
2,96 54
12,5
1056, 1
23,2 24,1
10
1088,7
1174,5
1295,7
18,2 32;6
6,15
85,8
7,8
12,6
82,4
7,12
13
255,8
11 15,76 33 173,4 20,9
3 5 41
1,34
479,8
0,08
17 мерений вычисляют удельную радиоактивность, строят кривые изменения количества клеток и удельной радиоактивности от времени фракционирования, по которым определяют продолжительность премитотической G<, син43,2 100 432
5,48 39 87,7
5 44,8 60 224
5 83 76 6э3 418в5
715,5
285,5 7,76 781,1
233:2 6,08 138)9
266,7 13,56 822,9
144,7 17,7
50,0 25,9
39,1 22,8
27,9 23,9
47,2 16,2
68,7 10,5
115,6 5,12
130,6 4,6
198,7 1,7
321,3 0,71
228 2 3 5 898в3
1451164
Продолжение табл.
1 2 3 4 5 б 7 8 9
42 9
940,3
1014,3
178,2 3,9
7 6,0 54
5 14 8 40 б 136 91
74 2,7
81,6 6,7
20
34,8 10 5
30,4 11,2
12,9 25
23
8,6
30,8
12,6 30, 9
20,9 20,9
11,4 36,8
14,4 20,1
21,8 18,2
6 1,9 70
10 1,44 29
952342
15,8 25,0
345,9
18,1 19,2
4226,9
Всего
Таблица 2
Концентрация клеток, кл./мл
«10»
Время сбора, ч
НакопОбъем фракций, мл
КолиКолиРадиоактивность фракции срт./мл
Удельная радиоактивность срт./кл.
«10 дельая раление, KJIO «103 чество кл./фр.
«103 чество кл./фр., кл. «10 иоакивность рт./кл.
«1Р3
117
2,6 7,5 117 2,88
1 45
5,4. 4,3 91,8 0,79 183,8 1,94 208,8
1,8 . 551,3
324,5
426,6
27,4 59
47,36 116
14,8 187
24,6 96
286,9
2,15
12,5
310,6
977,9
1140,1
5,7
2,45
286,4
194,9
12,3
162,8 12,6
7,1
3,9
270,6
1465,6
6,4
5,8 61
5,08 57
2,16 54
4,4 38
2,1 65
3,4 71
65,9 7,1
63,5 7,6
48,9 9,5
26,0 15,6
24,7 14,9
18,8 21,5
21,1 20,1
14,6 29,5
15 3 25,9.
1451164
Продолжение табл. 2 (1 2 3 4 5 6 7 8 9,6,0 97,1
160, 9
4,9
12 12,64 62 151,7
12 5,08 46,3 61
158, 1
218,6
7,1
91,1
9% 11
8,7
140,8
7,2
60,5
12,5 4,84 35
14,4
520
25, 12 248 301,4 9,87
16, 76 440 201; 1 26,2
6,48 426 77,8 65,7
10
721, 1
34,0
11 12
12 12
13 11
39,2
798,9
973,9
34,2
25,7
15,9 409 175
16,6 1254,7
15,1 1434,7
12,6 1864,5
31, 2 386 280, 8 12,4
212
15 - 6 30
353 180 11,8
216
6,5 29,2 621 189,8 20,98 309
16,4
14,4
559 4, 91 313
192 17,2 279
79,8 392
24 426
14,4
18,5
37,2
102,2
85,8 21,1
28,9 73,5
19
45,1
54,2
85,2
41,2
З0,9
15,8 140,9
31,5 59,1
53,6 40
31,8
22
33,6
ЗЗ,6
87,6
28,7
15,8 101,4
213
7,5 2,1
88
2,1
19,1
257
73
22,4
124
30 41,3
32,6 42
183
3,2
270,7
3 6
3373,9
Всего
6,5 13,2 279
8 5 3 4 250
8 6 247
7 5 2 1 236
7 4,5 266
8,5 6,3 252
16,8 121,9
24,8 40
25 6 57в2
39,6 26,7
187,6
193,4
151,3
178
1864, 5
318,6
510,6
550,9
14
Таблица 3
1451164
I
1 I
Культура
I Н I И 1 11 I ll gtl
"ах ФЭЧ-Л22 1, 11 9,7 5,16 15,6 7,83 20,98 2,62 17,25 15,95 ФЭЧ-Л23 — 3,64 1,82 9,73 10,12 21,7 0,68 15,48 16,32 Таблица 4. Культура Параметры ФЭЧ-Л23 ФЭЧ-Л22 5,3 (1,1-6,4) 2,2 (0-2,2) 12 ° 5 (3в9 16в4) 11э3 (1 ° 3 12е6) 5,5 (12,04-18,5) 6,3 (12,8-19,0) л. „10 q1 кл. 10 N,кл. >>10 793,2 (23,5Ж) 1465,6 (34,7X) 1295,7 (38,4Х) 1864,5 (44,17 1014,3 (39,1X) 550,9 (13,07) N второго цикла, кл х 10 345,9 (8,27) 0,0012 0,0002 0,945 0,998 П р и м е ч а, н и е. В скобках время начала и окончания стадии клеточного цикла. Т, ч Е Т, ч Tq ч ps s) 0,0005 0,00004 0,966 0,0005 0,00002 0,998 270,7 (8,0Х) 0,0101 0,0006 0,0009 0,0002 0,804 0)0004 0,00004 0,974 1451164 1451164 шэ Рнф7чшиь О РЩЮ1 ь Риаз Уд кмлимзИ Р9 ЯОшмм Р шэдО3УОЯ Составитель А.Спунде Техред А. Кравчук Редактор N.Íåäîëóæåíêî КоРРектоР И.Эрдейи Заказ 7036/20 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5 СССР Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4
