Штамм @ @ вкм в-1458-продуцент лизин-2-монооксигеназы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - выявление нового штамма бактерий Pseudomonas putida, обладающего повышенной активностью лизин-2-монооксигенаэы, и удешевление целевого продукта. Штамм отобран при сканировании микроорганизмов рода Pseudomonas, хранящихся в ВКМ. Штамм проявляет максимальную активность при культивировании на жидкой питательной среде, содержащей 3-4 г/д лизина или технического лизина, в течение 45 ч, равную 30,1 Е/г биомассы . Посевным материалом служит культура продуцента возрастом 60 ч. 4 ND

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1 (51) 4 С 12 N 9/04, 1/20 // (С 12 N 9/04, С 12 R 1:38) 0GNAPC78EHHb9 КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ЗСЧ 1 =""ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: g

3Ф

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3806960/28-13 (22) 30.10.84 (46) 15.05.87. Бюл. У 18 (72) А.Л.Симонян, Г.Э.Хачатрян, С.Ш.Татикян, Ц.М.Авакян и Т.В.Хачатрян (53).577.15(088.8) (5á) Takeda H., Hayaishi О. — I.Âioi.â

Chem., 1966, v. 241, р. 2733. (54) ШТАММ PSEUDOMONAS PUTIDA ВК!!

В-1458 — ПРОДУЦЕНТ ЛИЗИН-2-МОНООКСИГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения — выявление нового штамма бактерий Pseudomonas putida, обладающего повышенной активностью лизин-2-монооксигенаэы, и удешевление целевого продукта. Штамм отобран при сканировании микроорганизмов рода Pseudomonas, хранящихся в ВКМ.

Штамм проявляет максимальную активность при культивировании на жидкой питательной среде, содержащей 3-4 г/д лизина или технического лизина, в течение 45 ч, равную 30,.1 Е/г биомассы. Посевным материалом служит культура продуцента возрастом 60 ч.

0427

BKN В-1470/В-28/

BKM В-1471/В-22/

ВКМ В-1472/В-23/

BKM В-1473/В-25/

Pseudomonas

putida

BKM В-1458/В-20/

ВКМ В-1459/В-21/

ВКМ В-1460/В-34/

BKM В-)46! /В-39/

Pseudomonas

fluorescens

ВКМ В-1458-/В-20/

BKM В-1450/В-34/

Pseudomonas

fluorescens

70/314

1 )31

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению ферментов микробного происхождения и представляет собой штамм бактерий — продуцент фермента лизин-2-монооксигеназы /КФ 1.!3,12.2/ /IINC/, который может быть использован в микробиологической и медицинской промьш ленности, а также в медицине, Цель изобретения — выявление нового штамма бактерий Pseudomonas putida, обладающего повышенной активностью лизин-2-монооксигенаэы и удешевление целевого продукта.

Штамм отобран при сканировании микроорганизмов рода Pseudomonas, хранящихся в BKM и во ВНИИ сельскохозяйственных микроорганизмов г. Ленинграда:

Yseudomonas

fluorescens

70/314

71/405

Лизин-2-монооксигенаэная активность обнаружена при культивировании . на жидкой синтетической среде, содержащей L-лизин в качестве единственного источника углерода и азота в количестве 3-4 г/л в условиях аэрации в штаммах:

Pseudomonas

fluorescens BKM В-1470/В-28/

Pseudomonas

putida

Наибольшей активностью обладает штамм Ps. putida BKN В-1458/В-20/, имеющий следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства: время генерации в МПБ 6070 мин; клетки грамотрицательные, палочкообраэные, размером 1-3 мкм, подвижные, двигаются с помощью полярных жгутиков, бесцветные, при ферментации выделяют в культуральную жидкость пигмент зеленого цвета — пиовердин. На MIA после 24 ч инкубации

40 при 25 С образуются округлые колонии диаметром 2-3 мм беловато-серые, непрозрачные, гладкие,, блестящие с правильными краями. В центре колонии образуется небольшая выпуклость, При хранении колонии становятся мукоидными. Хорошо растет на МПА и в МПБ рН

7,2-7,5, На агаризованной синтетической лизинсодержащей среде после 48 ч инкубации размер колоний достигает

1-2 мм, Форма и цвет аналогичны. При культивировании в жидкой синтетической лиэинсодержащей среде выделение пиовердина происходит нерегулярно и зависит видимо от качества дистиллированной воды, Показано, что присутствие ионов железа стимулирует обра— зование пиовердина. Температура выше о

30 С подавляет рост культуры на синтетической среде.

Культура поддерживается на МПА.

Оптимальная температура роста 2426 С. При культивировании МПБ лизин-2-монооксигеназной активности не наблюдается. Она проявляется только при культивировании микроорганизма на синтетической лизин-содержащей среде.

Внутриклеточная ЛМО проявляет максимальную активность к 45 — 55 ч роста культуры на жидкой синтетической среде на поступательной качалке (100 качаний в минуту) °

Лизин-2-монооксигеназную активность определяют амперометрически по убыли концентрации кислорода в ячейке с перемешиванием объемом 5 ил. Реакционная смесь содержит 0,05 M калий-фосфатный буфер рН 8,0 и 0,02 М лизин. Реакция инициируется добавлением 0,07 мл бесклеточного экстракта, Пример 1, Культивирование продуцента лизин-2-монооксигеназы— штамма Pseudomonas putida ВКМ В-1458

/В-20/ проводят í; поступательной качалке (100 качаний в минуту) при

25 С в конических колбах объемом в о л, содержащих по 200 мл синтетической среды следующего состава, 7.:

?-лизин 0,3; К НРО+.ЗН О 0,15; КН РО

0,05; NgSC> 7Н О 0,02 (в дальнейшем синтетическая лизинсодержащая среда), Посевным материалом служит культура микроорганизмов, выращенных на поверхности скошенного мясопептонного агара, в течение 36 ч, Одной пробиркой со скошенным arapoM засевают одну ферментационную колбу. Длительность

7 4 этом активность ЛМО 30,1 E/ã биомасет существенно удешевить стоимость ростовой среды, а следовательно и фермента.

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas putida ВКМ

В-1458 (Всесоюзная Коллекция микроорганизмов ИБФМ АН СССР, коллекционный номер ВКМ В-1458 Д) — продуцент лизин-2-монооксигеназы.

Составитель И.Привалова

Техред M.Õoäàíè÷ КоРРектоР С.Шекмар

Редактор И,Сегляник

Заказ 1868/26 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r, Ужгород, ул. Проектная, 4

3 131042 культивирования 55 ч. В процессе культивирования рН не поддерживают, После 55 ч роста культуральную жидкость центрифугируют, клетки промывают

0,05 M калий-фосфатным буфером рН 8,0 5 вновь ресуспендируют в том же буфере, разрушают с помощью ультразвукового деэинтегратора УДЗН-1 и центрифугируют. В термостатируемую ячейку объемом 5 мл, содержащую 20 мМ раствор 10

L-лизина в калий-фосфатном буфере рН 8,0 вводят 70 мкл грубого клеточного экстракта и измеряют скорость потребления кислорода мембранным кислородным электродом в течение 1 мин, 15 после чего рассчитывают активность фермента. 3а единицу активности JIMO принимают то ее количество, которое расходует 1 микромоль кислорода в минуту. Полученная таким образом актив-gg ность составляет 29,8 Е/г биомассы, Пример 2, Культивирование продуцента проводят так же, как в примере 1,.но посевным материалом служит культура возрастом 60 ч, выра-25 щенная на синтетической агаризованной лизинсодержащей среде.

Длительность культивирования 45 ч, после чего клетки обрабатываются так же, как в примере 1. Полученная при 30 ! сы.

П р и и е р 3, Условия культивирования продуцента повторяют условия примера 2, но для удешевления среды используют в качестве источника углерода и азота в синтетической среде технический лизин с содержанием основного вещества 86Х, Активность JIMO

30,1 Е/r биомассы.

Таким образом, предлагаемый штамм

Pseudomonas putida В-1458 /В-20/ обеспечивает повышение активности целевого продукта с 19,8 до 30,1 Е/г биомассы по сравнению с известным, B процентном отношении это означает увеличение активности на 51Х. Использование технического лизина позволя