Способ выделения цитохрома с из дрожжей

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения цитохрома С. Цель изобретения - повышение частоты препарата и упрощение процесса выделения. Дрожжи выращивают в периодическом процессе на минеральной среде, содержащей соли: фосфорнокислый калий, сернокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо, дрожжевой автолит 32, и вкачестве источника углерода - этиловый спирт. Клетки дрожжей подвергают механической дезинтеграции при обработке 7-15%-ным раствором поваренной соли. Полученный дезинтеграт фракционируют путем ультрафильтрации последовательно на мембранах 100000, 30000 и 1000. Полученный на мембране 1000 концентрат белковой фракции, содержащей цитехром С, хроматографируют на катионном ионообменнике в аммонийно-фосфатном буфере PH 7,0. Затем раствор цитохрома С концентрируют, подвергают гель-фильтрации и лиофильно высушивают. Получают препарат с чистотой 99%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ABTOPCH0MY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4327597/30-13 (22) 16. 11.87 (46) 15.05,90 . Бюл. № 18 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (72) А.В.Темина, В.И.Козлов, А. В.Ильин, Е, Н, Косарева, В.А, Ежов и Л.В.Троицкая (53) 577. 15. 07 (088. 8) (56) Обалси А. Способ выделения из дрожжей цитохрома С, патент Японии, опубл. 46-39554, 1971, Автор ское свидет ель с тво СССР № 877934, 1983.

Methods Enlymol, 1969, v, 10, р. 339-348. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОИА С ИВ

ДРОЖЖЕЙ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения цитохрома С, Цель изобретения — повышение чистоИзобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения цитохрома С.

Цель изобретения — повьппение чистоты препарата цитохрома С и сокращение сроков выделения.

Пример 1. Дрожжи Candida

utilis штамм ВСБ-651 выращивают на минеральной среде следующего состава, г/л: калий фосфорно-кислый 3„ аммоний сернокислый 1; магний сернокислый 1; натрий хлористый 0,2; сернокислое железо 0,06; дрожжевой ав(51) 5 А 61 К 35/72, А 61 К 37/48, А 23 J 1/18, С 12 N 9/02

2 ты препарата и упрощение процесса выделения, Дрожжи выращивают в перио. дическом процессе на минеральной среде, содержащей соли: фосфорнокислый калий, сернокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо, дрожжевой автолизат, и в качестве источника углерода .этиловый спирт. Клетки дрожжей подвергают механической дезинтеграции при обработке 7 — 15X-ным раствором поваренной соли. Полученный дезинтеграт фракционируют путем ультрафильтрации последовательно на мембранах 100000, 30000 и 1000Д.Полученный на .мембране 1000 Д.концентрат белковой фракции, содержащий цитохром С, хроматографируют на катионном ионообменнике в аммонийно-фосфат-, ном буфере (рН 7,0).. Затем раствор цитохрома С концентрируют, подвергают гель-фильтрации и лиофильно высушивают. Получают препарат с чистотой 997, толизат 0,5, в качестве источника углерода используют ЗХ этанола.

К 2,5 кг сырой биомассы добавляют

1,5 л 7Х-ного раствора поваренной соли, размешивают мешалкой, подвергают дезинтеграции с дивинилстерольа ными шариками при 4 С в проточном режиме при шестикратном пропускании суспензии через баллистическую мельницу МЛ-1. Дезинтеграт центрифугируют при 3000 об/мин, осадок клеточных стенок промывают 7Х-ным раствором поваренной соли, затем водой в соот3 15б36 шенин 1-1,5. Супернатанты объединяи фракционируют путем ультрафильтации в установке "Пеликон" фирмы ллипор последовательно на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон.Концентрат фракции белков, обогащенной

Цитохромом С, собирают на мембране

1000 дальтон, промывают водой и затем хроматографируют в одну стадию а ионообменной колонке размером е . Ox200 мм, наполненной котионитом

RC-590 уравновешенным 0,15 М аммоно-фосфатным буфером (рН 7,0), концентрируют на мембране HN-10 "Amicon", подвергают гель-фильтрации а колонке размером 16х400 мм с сефадексом У-50 и лиофилизируют. Чистота препарата по белку 99%,Время, затраченное на выделение 100 мг цич охрдма С из биомассы дрожжей,соста ипо 20 ч

Пример 2, Дрожжи Candida uti1,is штамм ВСЕ-72б выращивают, по приМеру 1. Кпетки дрожжей дезинтегриру- 25 т в 10Х-ном растворе поваренной соли в баплистическом дезинтеграторе

ФУГ-1 в течение 1 ч при 2500 об/мцн с добавлением абразива в количестве 150 мл насыпного объема. Обработку дезинтеграта и дальнейшую очистку цитохрома С проводят по примеру

В качестве ионообменника применяЙт смолу БИОКАРБ Д, После гель-фильт- рации и лиофильной сушки получают

Электрофоретически чистый препарат.

Пример 3. Для выделения цитохрома С используют биомассу дрожжей Candida krusei штамм ВСБ-89б.Дрожжи дезинтегрируют в 15Х-ном растворе поваренной соли в аппарате ФУГ-1 при условиях дезинтеграции, описанных в примере 2. Ультрафильтрацию проводят по примеру 1. Катионит ХКС-50 уравновешивают 0,1 М аммонийно-фосфатным буфером с рН 7,0, а цитохром С элюируют с колонки 0,35 M аммонийно-фосфатным буфером с рН 7,0. Дальнейшую очистку цитохрома С проводят по примеру 1. Чистота полученного препарата выше 99% по белку (определенная спектральным методом, подтверждена методом гель-фильтрации высокоэффективной жидкостной хроматографии).

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет

2р получить препарат высокой чистоты.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ выделения цитохрома С из дрожжей, включающий внесение солевого раствора, дезинтеграцию клеток с экстракцией, фракционирование экстракта, ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты препарата и сокращения сроков выделения, в качестве солевого раствора используют

7-157.-ный раствор хлорида натрия, а фрикционирования осуществляют после-. довательно на ультрафильтрационных мембранах 100000, 30000, 1000 дальтон..г

Составитель Д,Папковский

Редактор М,Петрова Техред Л. Сердюкова Корректор 0,Ципле

Заказ 1114

Подписное

Тираж 565

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101