Инактивированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит антигенный материал в виде 10-20% вируссодержащей суспензии из штамма КР95 114 вируса СГПК, инактивант димер этиленимина (ДЭИ) и адъюванты - гидрат окиси алюминия и сапонин в эффективном соотношении. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным КР95 114-ДЕП. Штамм КР95 114 репродуцируется на 5-50-суточных цыплятах с титром инфекционной активности 3,25-5,0 1gЛД₅₀/0,2 см³. Вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь. Вакцина является нереактогенной, безвредной для привитой птицы и высоко иммуногенной. 10 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики синдрома гидроперикардита кур (СГПК).

СГПК (болезнь Ангара, болезнь Личи) - это остро протекающая инфекционная болезнь кур вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб развитому птицеводству многих стран мира.

Вирус СГПК вызывает заболевание кур преимущественно в возрасте от 10 до 50 суток, которое характеризуется внезапной гибелью птицы, скоплением избыточного количества жидкости в перикардиальной полости, поражением печени и почек, депрессией, диареей, а в некоторых случаях и анемией.

В августе 1987 года в Пакистане на бройлерной ферме в местности Angara Goth близ Карачи зарегистрировали болезнь с признаками гепатита с тельцами-включениями и поражением сердца (гидроперикардит). Заболевание отмечалось, как правило, у птиц 3-6-недельного возраста, но иногда встречалось у более молодых, либо более старших птиц, смертность достигала 50-70%. Первоначально заболеванию дали название "болезнь Ангара" в соответствии с географической местностью, где впервые зарегистрировали вспышку инфекции. Позднее заболеванию присвоили название "синдром гидроперикардита" в связи с тем, что при вскрытии трупов птиц отмечали скопление жидкости (до 20 мл) в сердечной сорочке, обусловленное нарушением кровообращения в сердечно-сосудистой системе. Подобное заболевание регистрировалось в Ираке, Индии, Мексике, Кувейте, Австралии, Японии и Чили (1).

С начала 90-х гг. вспышки СГПК с высоким уровнем смертности регистрируются на территории России (2). Отсутствие в отечественной ветеринарной практике средств и методов диагностики и специфической профилактики СГПК нанесло значительный экономический ущерб птицехозяйствам. Экономические потери, которые несут птицеводческие хозяйства от вспышек СГПК, складываются из падежа птиц (от 10 до 60%), гибели развивающихся эмбрионов кур во время инкубации, снижения продуктивности и оплаты корма, а также средств, затраченных на проведение внеплановых ветеринарно-санитарных мероприятий и др. (3) Вакцинопрофилактика СГПК занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием. Для профилактики СГПК применяют как живые, так и инактивированные вакцины. В последние годы наиболее часто применяют инактивированные вакцины (4). Однако проблема повышения их качества продолжает оставаться весьма актуальной и является основным направлением исследований по повышению иммуногенной активности и безвредности препарата и решения вопроса защиты птицеводства нашей страны от этой опасной болезни.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности признаков является инактивированная вакцина против СГПК, содержащая антигенный материал в виде очищенной вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем болезни и павших с признаками СГПК, и формальдегид в эффективных количествах (5).

Вакцина-прототип имеет существенные недостатки: - для получения антигена в качестве вирусного материала используют печень цыплят, павших во время вспышки СГПК, которая часто неоднородна по содержанию антигена, а также может быть контаминирована возбудителями других инфекционных болезней птиц (болезнь Гамборо, болезнь Марека, инфекционный бронхит, инфекционная анемия кур и др.); - в качестве инактиванта используют формальдегид, вызывающий деструктивные изменения вирусных белков и снижающий иммуногенную активность вакцины. Также велика вероятность неполной инактивации вируса при обработке формальдегидом вирусной суспензии, содержащей значительное количество балластного белка; - данный вакцинный препарат не имеет в своем составе адъювант, использование которого улучшает хранение и повышает антигенную активность вакцины; - вакцина-прототип обладает низкой антигенной и иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты против эпизоотического вируса СГПК, циркулирующего на территории Российской Федерации.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка высокоиммуногенной и безвредной инактивированной вакцины против вируса СГПК, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности и безвредности целевого продукта.

Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной вакцины против СГПК, охарактеризованной следующей совокупностью признаков: 1. Инактивированная вакцина против СГПК.

2. Антигенный материал в виде очищенной 10-20% вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных вирусом СГПК из штамма КР95 114 и павших с признаками СГПК.

3. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированного в организме 5-50-суточных цыплят.

4. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК с биологической активностью 3,25-5,0 lg ЛД₅₀/0,2 см³.

5. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

6. Инактивант 7. Из инактивантов димер этиленимина (ДЭИ).

8. ДЭИ в виде 10% водного раствора.

9. Дополнительно адъювант.

10. Из адъювантов гидрат окиси алюминия (ГОА).

11. ГОА в виде 3-4% коллоидного раствора.

12. Из адъювантов сапонин.

13. Сапонин в виде 10% водного раствора.

14. Инактивированная вакцина против СГПК содержит антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, ДЭИ, ГОА и сапонин в соотношении, мас.%: Антигенный материал - 50,0-80,0 ДЭИ (10% водный раствор) - 0,15-0,4 ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 17,6-49,35
Сапонин (10% водный раствор) - 0,5-2,0
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Инактивированная вакцина против СГПК.

2. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК.

3. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

4. Инактивант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированный в организме 5-50-суточных цыплят.

2. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК с биологической активностью 3,25-5,0 lg ЛД₅₀/0,2 см³.

3. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

4. Из инактивантов ДЭИ.

5. ДЭИ в виде 10% водного раствора.

6. Дополнительно адъювант.

7. ГОА.

8. ГОА в виде 3-4% коллоидного раствора.

9. Из адъювантов сапонин.

10. Сапонин в виде 10% водного раствора.

11. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, ДЭИ, ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
Антигенный материал - 50,0-80,0
ДЭИ (10% водный раствор) - 0,15-0,4
ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 17,6-49,35
Сапонин (10% водный раствор) - 0,5-2,0
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Инактивированная вакцина против СГПК.

2. Антигенный материал в виде очищенной вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем болезни и павших с признаками СГПК.

3. Инактивант.

По сравнению с вакциной-прототипом существенными отличительными признаками изобретения является то, что предлагаемая вакцина содержит антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, взятого в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированного в организме 5-50-суточных цыплят.

2. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК с биологической активностью 3,25-5,0 lg ЛД₅₀/0,2 см³.

3. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК в эффективном количестве.

4. Из инактивантов ДЭИ.

5. ДЭИ в виде 10% водного раствора.

6. Дополнительно адъювант.

7. Из адъювантов ГОА.

8. ГОА в виде 3-4% коллоидного раствора.

9. Из адъювантов сапонин.

10. Сапонин в виде 10% водного раствора.

11. Антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, ДЭИ, ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
Антигенный материал - 50,0-80,0
ДЭИ (10% водный раствор) - 0,15-0,4
ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 17,6-49,35
Сапонин (10% водный раствор) - 0,5-2,0
Предлагаемая вакцина обладает по сравнению с вакциной-прототипом более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что в состав инактивированной вакцины против СГПК введен антигенный материал из нового штамма КР95 114 вируса СГПК.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что вакцина содержит ДЭИ в качестве инактиванта, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенного материала.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности достигается также за счет использования адъювантов ГОА и сапонина.

В результате проведенных исследований установлено, что гель ГОА, внесенный в опытные серии вакцины против СГПК, повышал их антигенную активность с увеличением концентрации ГОА в прописи препарата. Так, у цыплят, привитых вакциной без ГОА, титр антител к вирусу СГПК по результатам РДП был на уровне 0,56+0,1 лог₂, а у цыплят, иммунизированных препаратами с ГОА - от 1,23±0,2 лог₂ до 3,85±0,2 лог₂.

Что касается сапонина, то в результате проведенных исследований установлено, что введение в состав инактивированной сорбированной вакцины против СГПК водного раствора сапонина в количестве от 0,1 до 2 мг на дозу приводило к повышению антигенной активности препарата в сравнении с вакциной без сапонина. Наиболее высокие показатели антигенной активности были зарегистрированы у вакцин, содержащих в своем составе сапонин в конечной концентрации от 0,1 до 1,5 мг на одну прививную дозу.

Исходный вирус для получения штамма КР95 114 выделен из печени больных бройлеров на птицефабрике "Красноярская" Красноярского края в 1995 году. Производственный штамм КР95 114 получен путем многократных последовательных пассажей на цыплятах. Штамм КР95 114 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 14.12.2000 под регистрационным номером КР95 114-ДЕП. Штамм является вирулентным и обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины против СГПК.

Штамм КР95 114 вируса СГПК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм КР95 114 вируса СГПК относится к семейству Adenoviridae, роду Aviadenovirus, группе 1, серотипу 4, обладает морфологическими признаками, характерными для аденовирусов: как у всех прочих вирусов этого семейства, лишенных суперкапсидной оболочки, диаметр вириона штамма КР95 114 и нуклеокапсида равны. Размер вириона равен 75-80 нм. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Вирион представлен нуклеоидом, состоящим из нуклеиновой кислоты и сердцевинных белков, и капсидной белковой оболочкой. Капсид содержит 252 капсомера, которые расположены в 20 фасетках, имеющих форму равносторонних треугольников. На ребрах равносторонних треугольных граней, общих для соседних треугольников, лежит по шесть капсомеров; длина ребра составляет около 42 нм. Каждый из 240 капсомеров капсидной оболочки, формирующих равносторонние треугольники, находится в окружении шести таких же капсомеров и носит название гексон. Каждый из 12 капсомеров, расположенных в вершинах икосаэдра, окружен лишь пятью соседними капсомерами и носит название пептона. Каждый капсомер (кроме сложно устроенного пептона) представляет собой призматическую частицу диаметром 6-7 нм с центральной полостью размером 1,5-2 нм. Способ укладки капсомеров в капсид является уникальным для вирусов с икосаэдрическим типом симметрии и отличается геометрической упорядоченностью. Гексоны представляют собой основной растворимый компонент возбудителя при его репродукции в чувствительных клетках.

С пептонами связывают их способность агглютинировать эритроциты, что обусловлено присутствием в их составе полного гемагглютина.

Сердцевина вириона содержит двухцепочную молекулу ДНК и два внутренних белка. ДНК имеет в своем составе около 60 генов, несущих информацию, которая достаточна для кодирования от 30 до 50 белков.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм КР95 114 относится к группе 1 птичьих аденовирусов. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:2-1:64.

Биотехнологические характеристики
Штамм КР95 114 является вирулентным и обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации.

Штамм КР95 114 предназначен для использования в качестве сырья для изготовления инактивированной вакцины, а также диагностических биопрепаратов. Штамм КР95 114 репродуцируется на цыплятах 5-90-суточного возраста. В течение 48-120 часов инкубирования вирус накапливается в печени цыплят в титре 3,25-5,0 lg ЛД₅₀/0,2 см³. Штамм КР95 114 является стабильным.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Сердцевина вириона содержит двухцепочечную молекулу ДНК и два внутренних белка. Масса нуклеиновой кислоты достигает 17,3% массы вириона.

Основная масса белков вируса СГПК сосредоточена в капсидной оболочке вириона. На долю сердцевинных белков приходится до 20% всех протеинов вируса. Сердцевинный белок "1" с молекулярной массой 46•10³ г/моль легко отделяется от внутреннего нуклеопротеида, содержащего ДНК в комплексе с богатым аргинином сердцевинным белком "2".

Гексон, основание пептона и его нить (фибер) вируса К95 114 построены из полипептидов с молекулярными массами 120•10³, 70•10³, 62•10³ г/моль соответственно.

Белковые структуры вируса штамма КР95 114 формируют несколько антигенов. В составе структурного вирусного антигена у них обнаружены типоспецифические, группоспецифические, подгруппоспецифические антигены полипептидов гексона, основания пептона и подгруппоспецифические и типоспецифические антигены нити пептона.

В составе структурного вирусного антигена выявлено три основных компонента, обозначенных А, В и С. Антиген А структурно связан с гексоном, антиген В - с пептоном, антиген С - с нитями вириона (фибер). Связанный с гексоном компонент А содержит группоспецифический антиген (α) и типоспецифический антиген (ε). Антигенный фактор, связанный с пептоном, назван антигеном (β), а с нитью вириона (фибер) - (γ).
Физические свойства
Масса вириона - 252х10³ г/моль. Плавучая плотность 1,32-1,35 г/мл в градиенте C_SCl. Константа седиментации зрелого вириона равна 810•10^-13 - 910•10^-13 с.

Устойчивость к внешним факторам
Штамм КР95 114 устойчив к действию эфира, хлороформа, сапонина и дезоксихолата натрия, чувствителен к формальдегиду, β-пропиолактону, гидроксиламину, производным этиленимина, УФ-облучению, γ-облучению.

Штамм КР95 114 довольно устойчив к нагреванию и к изменению рН среды в широком интервале, резистентен к действию 0,25% раствора трипсина, 2% раствора фенола и 50% раствора этилового спирта. Абсолютный этанол, как и его йодный раствор, вызывает полную инактивацию вируса.

Штамм КР95 114 устойчив к многократному повторению циклов замораживания и оттаивания, не теряет инфекционных свойств при сублимационном высушивании.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - 100%
Патогенность выражена
Вирулентность выражена
Контагиозность выражена
Онкогенность отсутствует
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм КР95 114 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса СГПК. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная вакцинопрофилактика вновь возникающих очагов болезни, для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1.

Для получения вакцины из штамма КР95 114 матровым вирусом внутримышечно в объеме 1 см³ заражают 5-50-суточных цыплят, полученных из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Цыплят содержат 120 часов после заражения. У больных и павших цыплят отбирают печень. Печень подвергают размолу на коллоидной мельнице в течение 10-12 минут, затем вируссодержащую массу смешивают с фосфатным буферным раствором, получая в результате 10-20% вируссодержащую суспензию. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей известным образом. Для этого можно использовать низкоскоростное центрифугирование, обработку суспензии различными детергентами (фреон-113, хлороформ) и флокулянтом высокомолекулярным полигексаметиленгуанидингидрохлоридом (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием или сепарированием. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных белков проводят при 6-12^oС. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор. Для инактивации вируса используют димер этиленимина (ДЭИ). Предварительно готовят 10% раствор ДЭИ на деминерализованной воде рН 7,9-8,0. Затем в подогретую до 28-34^oС вируссодержащую суспензию вносят 10% раствор ДЭИ до концентрации 0,15-0,4%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 35-36^oС в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8^oС. В качестве адъюванта-сорбента в вакцине используют стерильный 3-4% коллоидный раствор ГОА. рН ГОА устанавливают в пределах 7,5-7,6 и охлаждают до 2-8^oС. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют ГОА до концентрации 0,1%. Затем к смеси дополнительно добавляют 10% водный раствор адъюванта сапонина из расчета 0,5 мг на дозу вакцины, доводя концентрацию сапонина в вакцине до 0,5-2%. После перемешивания смеси в течение часа определяют рН препарата и при необходимости доводят его значение до 7,4-7,6. Полученную вакцину контролируют на авирулентность, безвредность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89.

Авирулентность и безвредность препарата определяют путем введения 10-15-суточным цыплятам вакцины в тройной дозе.

Полученная вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Полученная вакцина против СГПК имеет оптимальный компонентный состав (рецептура), представленный в таблице А.

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Пример 2.

Проведены исследования по определению антигенной активности инактивированной вакцины против СГПК, полученной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Очищенный антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированного в организме 30-суточных цыплят с титром инфекционной активности 3,3 lg ЛД₅₀/0,2 см³ (10% суспензия) - 50,0
ДЭИ (10% водный раствор) - 0,15
ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 49,35
Сапонин (10% водный раствор) - 0,5
Антигенную активность вакцины определяли на цыплятах 15-суточного возраста, свободных от антител к вирусу СГПК. Вакцину вводили в дозе 0,3 см³ в мышцу бедра. Через 21 сутки после вакцинации у цыплят отбирали кровь, получали сыворотки и их исследовали в РДП со специфической сывороткой, гипериммунной к вирусу СГПК. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о высокой антигенной активности инактивированной вакцины против СГПК из штамма КР95 114.

Пример 3
Проведены исследования по определению антигенной активности инактивированной вакцины против СГПК, полученной так, как описано в примере 1,и содержащей, мас.%:
Очищенный антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированного в организме 30-суточных цыплят с титром инфекционной активности 3,54 lg ЛД₅₀/0,2 см³ (10% суспензия) - 70,0
ДЭИ (10% водный раствор) - 0,2
ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 28,8
Сапонин (10% водный раствор) - 1,0
Определение антигенной активности проводили на цыплятах 12-суточного возраста, свободных от антител к вирусу СГПК. Вакцину вводили в дозе 0,3 см³ в мышцу бедра. Через 21 сутки после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и их исследовали в РДП на наличие антител к вирусу СГПК. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой антигенной активности инактивированной вакцины против СГПК из штамма КР95 114.

Пример 4.

Проведены исследования по определению антигенной активности инактивированной вакцины против СГПК, полученной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Очищенный антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированного в организме 30-суточных цыплят с титром инфекционной активности 3,25 lg ЛД₅₀/0,2 см³ (10% суспензия) - 80,0
ДЭИ (10% водный раствор) - 0,4
ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 17,6
Сапонин (10% водный раствор) - 2,0
Антигенную активность вакцины определяли на цыплятах 18-суточного возраста, свободных от антител к вирусу СГПК. Вакцину вводили внутримышечно в объеме 0,3 см³ в область бедра. Через 21 сутки после вакцинации у цыплят отбирали кровь, получали сыворотки и их исследовали в РДП на наличие антител к вирусу СГПК. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой антигенной активности инактивированной вакцины против СГПК из штамма КР95 114.

Пример 5.

Приведены исследования по определению иммуногенной активности инактивированной вакцины против СГПК, полученной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Очищенный антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированного в организме 35-суточных цыплят с титром инфекционной активности 3,25 lg ЛД₅₀/0,2 см³ (10% суспензия) - 70,0
ДЭИ (10% водный раствор) - 0,2
ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 28,8
Сапонин (10% водный раствор) - 1,0
Для этого была поставлена серия опытов на цыплятах 10-суточного возраста, не имеющих антител к вирусу СГПК, которые служили биологической моделью для проверки иммунного ответа птицы на введение вакцины. В опыт было взято 350 цыплят, которых разделили на девять групп по 50 голов в каждой. Восемь групп являлись подопытными, которым вводили вакцину, и одна группа служила контролем. Цыплят опытных групп прививали однократно внутримышечно в дозах 0,15, 0,3 и 0,5 см³ инактивированной сорбированной вакциной 2 и 5 серии. На 3, 5, 7, 10 и 14 сутки после вакцинации из каждой группы отбирали по 10 цыплят, которых помещали в отдельный бокс и заражали внутримышечно вирусом СГПК из штамма КР95 в дозе 3,78±0,23 lg ЛД₅₀/0,2 см³. После контрольного заражения за птицей вели наблюдение в течение 10 дней. Павших цыплят регистрировали и подсчитывали процент защиты. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 4. Как видно из данных, приведенных в таблице 4, однократная вакцинация цыплят в дозе 0,5 см³ обеспечивала 100% защиту от контрольного заражения уже через 3 суток после введения препарата. В группах цыплят, которым вводили инактивированную сорбированную вакцину в дозах 0,15 и 0,3 см³, 100% защита от контрольного заражения наступала на 5-7 сутки после вакцинации. Смертность в контрольной группе цыплят была на уровне 80-100%.

Пример 6.

Проведены исследования по определению фактической иммуногенной активности (ИмД₅₀/см³) и протективной активности прививной дозы инактивированной сорбированной вакцины против СГПК, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Очищенный антигенный материал из штамма КР95 114 вируса СГПК, репродуцированного в организме 35-суточных цыплят с титром инфекционной активности 3,25 lg ЛД₅₀/0,2 см³ (10% суспензия) - 70,0
ДЭИ (10% водный раствор) - 0,2
ГОА (3-4% коллоидный раствор) - 28,8
Сапонин (10% водный раствор) - 1,0
Для этого были поставлены опыты на цыплятах яичного кросса 8-суточного возраста, не имеющих антител к вирусу СГПК. В опытах использовали цыплят общим количеством 250 голов. Цыплят прививали инактивированной сорбированной вакциной против СГПК 2, 3 и 5 серий. Иммуногенную активность образцов вакцины определяли объемным методом с применением расчетов по формуле Кербера-Ашмарина. ПД₅₀ вакцины расчитывали путем деления прививной дозы вакцины на значение ИмД₅₀. Результаты исследований приведены в таблице 5. В опытах установлено, что на иммуногенную активность инактивированной вакцины против СГПК существенно не влияет способ введения препарата. Так, ИмД₅₀ при введении вакцины подкожно была равна 0,0107 см³, а внутримышечно - 0,012 см³. Из данных таблицы 5 видно, что одна прививная доза вакцины в объеме 0,3 см³ при подкожном введении препарата содержит 28±1,15 ПД₅₀, а одна прививная доза вакцины в объеме 0,3 см³ при внутримышечном введении содержит 25±1,15 ПД₅₀. Серию вакцины выпускают для практического применения, если в максимальном прививочном объеме для цыплят, равном 0,5 см³, содержится не менее 7 ПД₅₀.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- инактивированная вакцина против СГПК, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в описании или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемой вакцины против СГПК достигнут технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Cowen B. S., Lu H. et al. Characterization studies of fowl adenoviruces associated with inclusion body hepatitis / hydropericardium syndrome in chickens. Presented at the 68-th Northeastern Conference in Avian Diseases. June 10-12 1996, p.14.

2. Лагуткин НА, Арсентьев А.Р. и др. Массовый гидроперикардит у мясных цыплят раннего возраста. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Материалы научн. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1992,4.2,248-251.

3. Borisov V.V., Borisov A.V. et.al. Hydropericardium syndrome in chickens in Russia // Proc. of the 11^th Int. Congress of the World Vet. Poult. Ass. August 18-22, Budapest, Hungary. - 1997. - P.258.

4. Winterfield R.W., Fadly A.M. et al. Immunisation of chicken against adenovirus infection. Poult. Sci., 1977, V.56, N 5, 1481-1486.

5. Ahmad I., Malik M.I. et. al. Efficacy of formalinized level-organ-vaccine against Angara disease in broilers // Veterinarski Arhiv. - 1990. - V.60. - N 3. - P. 131-138 (прототип).

Формула изобретения

1. Инактивированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур, содержащая антигенный материал в виде очищенной вируссодержащей суспензии из печени цыплят, инфицированных возбудителем инфекции и павших с признаками синдрома гидроперикардита кур, и инактивант, отличающаяся тем, что содержит антигенный материал из штамма вируса синдрома гидроперикардита кур сем. Adenoviridae, род Aviadenovirus, группа 1, серотип 4, коллекция ВГНКИ КР95 114-ДЕП в эффективном количестве.

2. Инактивированная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что содержит антигенный материал из штамма КР95 114-ДЕП вируса синдрома гидроперикардита кур, репродуцированного в организме 5-50 суточных цыплят.

3. Инактивированная вакцина по любому из пп. 1 и 2, отличающаяся тем, что содержит антигенный материал из штамма КР95 114-ДЕП вируса синдрома гидроперикардита кур с биологической активностью 3,25-5,0 1gЛД₅₀/0,2 см³.

4. Инактивированная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что из инактивантов содержит димер этиленимина.

5. Инактивированная вакцина по п. 4, отличающаяся тем, что содержит димер этиленимина в виде 10%-ного водного раствора.

6. Инактивированная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что содержит дополнительно адъювант.

7. Инактивированная вакцина по п. 6, отличающаяся тем, что из адъювантов содержит гидрат окиси алюминия.

8. Инактивированная вакцина по п. 7, отличающаяся тем, что содержит гидрат окиси алюминия в виде 3-4%-ного коллоидного раствора.

9. Инактивированная вакцина по п. 6, отличающаяся тем, что из адъювантов содержит сапонин.

10. Инактивированная вакцина по п. 9, отличающаяся тем, что содержит сапонин в виде 10%-ного водного раствора.

11. Инактивированная вакцина по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что содержит антигенный материал из штамма КР95 114-ДЕП вируса синдрома гидроперикардита кур, димер этиленимина, гидрат окиси алюминия и сапонин в соотношении, мас. %:
Антигенный материал - 50,0-80,0
Димер этиленимина - 0,15-0,4
Гидрат окиси алюминия - 17,6-49,35
Сапонин - 0,5-2,0

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3