Способ получения вакцины против вируса гриппа

 

Способ заключается в ковалентной конъюгации активированного полиоксидония MM = 20-40 тыс. Д со смесью гемаглютинина и нейраминидазы, причем массовое соотношение полимера к белку составляет 1,5 - 3:1, и процесс ведут при 0-4^oC. Предлагаемый способ получения новой искусственной полимер-субъединичной гриппозной вакцины позволяет значительно повысить ее иммуногенность, сформировать иммунологическую память, резко снизить дозу препарата м получить эффект от вируса гриппа актуального штамма. Вакцинный препарат является безвредным и может быть рекомендован для введения людям. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и медицине, в частности к способам искусственных полимер-субъединичных вакцин, которая может быть использована при профилактике гриппа различных серогрупп. Цель изобретения повышение технологичности способа за счет устранения побочных реакций, повышения эффективности очистки, увеличения иммуногенности, длительности иммунной защиты целевого продукта. Изобретение иллюстрируется примерами. Пример 1. Получение препарата ИПС-1 проводят в две стадии. Первая стадия синтез активированного полиоксидония сукцинимидного эфира сополимера N-окиси этиленпиперазина и N-ацетилэтиленпиперазиний бромида по известной методике. 50 мг полиоксидония ( ММ 40 тыс. 0,15 ммоль COOH-группы) суспендируют в 2 мл диметилформамида, добавляют при перемешивании 38,6 мг (0,15 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и 18 мг (0,15 ммоль) N-гидроксисукцинимида. Реакцию проводят при перемешивании и охлаждении (2-4^oС) в течение 24 ч. Для очистки осадок многократно промывают диоксаном, эфиром и ацетоном, высушивают в вакуумном сушильном шкафу. Отсутствие низкомолекулярных примесей проверяют методом тонкослойной хроматографии на пластинах "Силуфол" в системе н-бутиловый спирт вода - уксусная кислота 4:1:1. Содержание активированных групп определяют стандартным методом (pH 8,5, 0,1 M водородный p-p NH₃ 259 нм, коэффициент экстинкции ε= 9700); в 1 г активированного полиоксидония содержится 9·10^-4 молей активированный групп. Вторая стадия. 12 мг активированного полиоксидония растворяют в 2 мл фосфатного буфера pH 6,0, 0,05 M. При перемешивании и охлаждении добавляют раствор 4 мг гемагглютинина и нейраминидазы (соотношение соответственно 95:5) в 20 мл фосфатного буфера 0,05 M pH 7,5, содержащего 0,05 M NaCI (соотношение 3:1). Реакцию конденсации проводят в течение 18 ч при 0^oC. После окончания реакции смесь наносят на колонку, заполненную биогелем P 100 (2,6 x 60), в качестве элюента используют фосфатный буфер 0,05 M pH 7,5, 0,05 M NaC1. Выход конъюгата (95) контролируют с помощью проточного спектрофотометра при 226 нм, собирают пик, выходящий в свободном объеме. Определение содержания блока проводят методами кругового дихроизма, флуоресцентной спектроскопии. Анализ конъюгата проводят методом электрофореза в ПААГ (10), морфологическое изучение методом электронной спектроскопии (JoeI 100 CX, негативное контрастирование). В 1 мг препарата содержится 0,25 мг белков гемагглютинина и нейраминидазы (процентное соотношение ГА:НА 95:5). Пример 2. Получение препарата ИПС-3 проводят аналогично приведенному в примере 1 методу. ММ исходного полиоксидония 40000, на второй стадии синтеза в реакцию конъюгации вводят 12 мг активированного полиоксидония и 8 мг белков гемагглютинина и нейраминидазы (соотношение ГА НА составляет 95:5). В 1 мг препарата содержание белков составляет 0,5 мг. Пример 3. Процесс проводят аналогично примеру 1, используя полиоксидоний ММ 20000, при 0^oC и соотношении полимера к белку 1,5:1. В 1 мг препарата содержится 0,5 мг белков гемагглютинина и нейраминидазы. Пример 4. Процесс проводят аналогично примеру 1 (ММ 20000, соотношение 3:1), при температуре 0^oC. В 1 мг препарата содержит 0,25 мг белка. Пример 5. Процесс проводят аналогично примеру 1 при соотношении полимер: белок, равном 1,5-1, и температуре 4^oC. В 1 мг препарата содержит 0,5 мг белка. Пример 6. Оценка специфической иммуногенной активности ИПС-вакцины. Опыты проводились на мышах (CBA x C57BL)F₁ весом 18 20 г. Мышей иммунировали двукратно внутрибрюшинно ИПС-вакциной, в дозе 0,1 мкг белка (гемагглютинина и нейраминидазы при соотношении 95:5) на мышь. Время между двумя иммунизациями составляет 3-4 недели. Через 12 дней после 2-й иммунизации отбирали кровь и выделяли сыворотку. В качестве контрольной использовали сыворотку неиммунизированных мышей. Для сравнения исследования также сыворотку крови мышей иммунизированных коммерческой инактивированной вакциной, выпущенной предприятием по производству бакпрепаратов им. Пастера (Ленинград), в дозе 5 мкг белка на мышь. Дозу вводили однократно в соответствии с наставлением по применению. Исследовали также сыворотку крови мышей, иммунизированных дважды указанной выше коммерческой вакциной в дозе 0,1 мкг белка на мышь. Проводилось сравнение иммуногенных свойств предлагаемой вакцины и прототипа. Уровень специфических антител изучали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), в реакции нейтрализации (PH) в стандартной постановке этих методов и методов иммуноферментного анализа (ИФА). За титр сыворотки в РТГА принимали наибольшее разведение сыворотки, при котором отмечается торможение гемагглютинации. За титр сыворотки в реакции нейтрализации принимали ее наибольшее разведение, вызывавшее не менее, чем в 50 эмбрионов (т.е. в 3 эмбрионах из 6) нейтрализацию вируса. Результаты представлены в табл. 1 и 2. Из представленных в табл. 1 и 2 данных видно, что ИПС-гриппозная вакцина проявляет более выраженный иммуногенный эффект по сравнению с коммерческой вакциной и вакциной по способу-прототипу. Таким образом, предлагаемый способ получения новой вакцины против вируса гриппа позволяет значительно увеличить иммуногенность, вызвать формирование иммунной памяти, значительно снизить дозу препарата. Использование в способе носителя позволяет отказаться от конденсации карбодиимидным способом (бифункциональным агентом), который приводит к неконтролируемой сшивке макромолекул и потере функциональных свойств у конъюгета. Использование в качестве сорбента биогеля P-100 позволило существенно повысить процент выхода по конъюгату, который составляет 80 100% по сравнению с выходом 20 30% в способе-прототипе.

Формула изобретения

Способ получения вакцины против вируса гриппа путем прививки поверхностных белков вируса на полимерный носитель, отличающийся тем, что, с целью повышения технологичности способа за счет устранения побочных реакций, повышения эффективности очистки, увеличения иммуногенности, длительности иммунной защиты, в качестве полимерного носителя используют сукцинимидный эфир сополимера N-окиси этиленпиперазина и N-ацетилэтилен-пиперазиний бромида с ММ 20 40 тыс.Д, а в качестве поверхностных белков вируса гриппа смесь гемагглютина и нейтрамидазы при их весовом соотношении и носителю 1:1,5 3, взаимодействия проводят на холоде с последующим выделением и очисткой конъюгата на биогеле P-100.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 14.05.2007

Извещение опубликовано: 27.07.2008        БИ: 21/2008

---