Штамм бактерий вrеviвастеriuм sтатiоnis - продуцент nad- киназы
Изобретение относится к биотехнологии , в частности к применению штамма в качестве продуцента фермента NAD-киназы. Цель изобретения - получение нового штамма Brevibacterium stationis (1228) ВКПМ В-4490-продуцента метафосфатзависимой NAD-киназы более высокой активности. Штамм выращивают на среде с ферментным гидролизатом БВК следующего состава, г/л: гидролизат БВК 25; глюкоза 5; 1; 1; MgS04 0,1; рП 7,2 в течение 13-20 ч при температуре 30°С в аэробных условиях. Активность метафосфатзависимой NAD-киназы в активизированных ацетоном клетках соа ставляет в среднем 15мкмоль NADP/1 ч/1 г jS биомассы клеток. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
Ai (19) (! !) (gg)g C 12 N 9/12, I/20
ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИЯ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
К А BTOPCHGMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4649846/13 (22) 13.02.89 (46) 28 ° 02.91. Бюл. - 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (72) Г.!О. Некрашайте, P.Ê. Вайткявичюс, И.К.СтреЪкувене и P.Ñ.Âàðàíàóñкайте (53) 577.15(088.8) (56) Kousaku Nurata, Jyoj i, Kata, Ichiro Chibata, Continuous Production of NADP by Immobilized Brevibacterium ammoniapenes Cells. — Bio tecnology and Bioen8ineering, 1979, 21, р, 887-895. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВКЕЧТВАСТЕКПЗМ
STATI0NIS — ПРОДУЦЕНТ NAD-КИНАЗЫ
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к применению штамма в качестве продуцента фермента метафосфат — зависимой NAD-киназы.
Цель изобретения — получение нового штамма Breviba terium stationis (1228) ВКПИ В-4490 продуцента метафосфатзависимой NAD-киназы, обладающего более высокой активностью, Штамм Brevibacterium stationis
1228 является коллекционной типовой культурой Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов при Академии наук СССР.
Итамм Brevibacterium stationis .1228 характеризуется следующими свойствами, Морфологические признаки: клетки палочковидные (0,5-1,2х1 4) мкм пря2 (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к применению штамма в качестве продуцента фермента NAD-киназы. Цель изобретения— получение нового штамма Вге 1Ьас ег1um stationis .(1228) ВКПМ В-4490-продуцента метафосфатзависимой NAD-киназы более высокой активности. Штамм выращивают на среде с ферментным гидролизатом БВК ледукщего состава, г/л: гидролизат БВК 25; глюкоза 5;
KII POp 1; К НРОр 1; i4pSO 0,1; pii 7,2 в течение 13-20 ч при температуре
30 С в аэробных условиях. Активность метафосфатзависимой NAD-Kèíàçû в активизированных ацетоном клетках составляет в среднем 15 мкмоль NADP/1 ч/1 r Ж биомассы клеток. 1 табл. мые или слабо искривленные, 48-часовая культура состоит полностью из кокковидных клеток. Кокковидные клетки овальные, образуются путем многократной фрагментации более крупных клеток. Цикл развития: кокк — палочка — кокк. Палочки неподвижны. Грамположительные.
Культурально-физиологические признаки: на агаризованной среде колонии круглые, выпуклые, гладкие с ров- ным краем, маслянистые. Pocт медленный. После 24 ч роста диаметр колонии менее 1 мм. На мясопептонном агаре (IIIIA) на пятые сутки роста — колонии диаметром 5-6 мм, желтые, на МПА, изготовленном на искусственной морской воде, — колонии диаметром 2,53 мм, светло-желтые, на гидролизате казеина с дрожжевым экстрактом
1631079 (ТУ 6-09-10-292-74) — колонии диаметром 3 мм, светло-желтые.
Оптимальная температура роста
28-30 C рН среды 7,0. Хорошо растет на среде C ферментным гидролизатом
БВК (БВК вЂ” кормовые дрожжи, выращенные на парафинах нефти) ° Хорошо усваивает глюкозу., фруктозу, глицерин, этанол, метанол, цитрат натрия, ацетат аммония или натрия; вазелиновое масло в качестве источника углерода °
Микроорганизмы выращивают на среде следующего состава, г/л: гидролизат БВК 25; глюкоза 5; К НРО4 1;
КН РО4 1; NgS04 0,1, рН вЂ” 7,2, в течение 13-20 ч при температуре 30 С в аэробных условиях. Активность метафосфатзависимой NAD-киназы в активизированных ацетоном клетках состав- 20 ляет в среднем 15 мкмоль NADP/ 1 ч/1 r биомассы клеток.
II р и м е р. Культуру поддерживают в пробирках с косяками стерильного, 2Ж мясопептонного arapa. К мясопеп- . 25 тонному бульону добавляют 27 arapa
1 среду разливают в пробирки и стерилизуют 30 мин при 1,0 атм. Культуру выращивают в термостате при 30 С в о течение 24 ч и используют для получения посевного материала. Приготовленная таким способом культура Brevi-
bacterium stationis 1228 пригодна к употреблению в течение 1 мес в условиях хранения при 4+1 С.
Посевной материал выращивают в колбах на среде следующего состава, г/л: гидролизат БВК 25; глюкоза 5;
КН РО4 1 К НРО4 1 Ng$04 0 1 рН среды без глюкозы 7.4. Технология приготовления среды: среду (без глюкозы) разливают по 100 мл в конические колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при 0,8 атм 30.мин, отдельно готовят 25Х-ный раствор глюкозы, стери-, лизуют 20 мин при 0,5 атм и добавля-
«,45 ют по 2 мл в каждую колбу непосред,ственно перед засевом, Стерилизованную среду засевают с
arapa культурой Brevibacterium зСа-: 0
tionis 1228. Посевной материал выра-! щивают в. условиях перемешивания на круговых качалках с радиусом вращения 25 мм и частотой 220 мин, при
3OsG.в течение 24 ч. Приготовленный таким способом посевной материал слу55. жит в качестве инокулята.
Для получения NAD-киназы продуцент культивируют в колбах (20 колб) на среде такого же состава, как и для приготовления посевного материала.
Засев проводят, добавляя в кажпую колбу по 1 мл инокулята. Микроорганизмы вырапивают в течение 20 ч при о
30 С на круговых качалках с радиусом вращения 25 мм и частотой 220 мин
Полученная таким способом биомасса клеток содержит метафосфатзависимую
NAD-киназу с активностью препарата
14+3 мкмоль NADP/1÷/1 r активизированной биомассы клеток.
Пример 2. Ферментацию продуцента проводят в 20-литровом ферментере, содержащем 15 л питательной среды. Посевным материалом служат клетки, предварительно выращенные в колбах.на круговой качалке в течение 24 ч (пример 1). Для засева ферментера используют посевной материал в количестве 17 от общего объема среды (150 мл). Культивиро-. вание производят при аэрации 9 мз /ч, перемешивании 600 об/мин, 30 С в течение 15 ч, рН в процессе культивирования не поддерживают. Полученная таким способом биомасса клеток содержит метафосфатзависимую ИАВ-киназу с активностью 8,2 мкмоль NADP/1ч/1 г биомассы клеток.
Пример 3. Культивирование проводят в ферментерах емкостью
0,25 м при объеме среды 0,1 м, ЗО .С, подаче воздуха 90 м /ч и постоянном перемешивании (поддержание культуры, приготовление посевного материала, среда, как и в первом примере) ° Для засева ферментера используют посевной материал в количестве
1Х от общего объема среды (1 л). Время роста 12 ч. Бактериальные.клетки собирают на проточной центрифуге.
Полученная таким способом биомасса клеток содержит метафосфатзависииую ИАЭ-киназу с активностью
12,5 мкмоль БАЭР/1 ч/1 r биомассы клеток.
Активность метафосфатзависимой
NAD-киназы оценивают в нативных клетках следующим способом: отделенную и промытую биомассы клеток активируют и одновременно обезвоживают охлажденным до 5 С ацетоном. Реакционная смесь для.исследования синтеза NADP при участии NAD-киназы содержит
3 мкмоль NAD, 10 мкмоль ИяС12, 4 мг метафосфата, растворенных и 0,05 М трис-НС1-буфере, рН 8,0, и 0,2 мл
Штамм бактерий Brevibacterium
stationis ВКПИ В-4490 - продуцент
NAD-кинаэы.
Продуцент
Способ получения
Brevibacterium
ammoniagenes
2АИ 1645
Brevibacterium
stationis
1228
1,77
Известный
Колбы
Колбы
14,3
Предлагаем rA
20-литровый ферментер
0,25 м ферментер
8,2
12 5
Составитель И. Чаплина
Редактор Л, Пчолинская Техред Л.Сердюкова Корректор А. Осауленко.;
Заказ 524 Тираж 362 . . Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101
5 163 препарата клеток (10 мг обработанных ацетоном клеток, суспендированных в том же буфере). Общий объем 1 мл.
Инкубйцию проводят при 37 С в тече ние 1 ч. Реакцию останавливают, выдерживая реакционную смесь в кипящей водяной бане в течение 2 мин. Для определения образовавшегося в ходе энзиматической реакции NADP используют энзиматический метод, основанный на измерении абсорбции ультрафиолетового света при длине волны 340 нм восстановленной формы кофактора, образующейся в ходе индикаторной энзиматической реакции с применением NADP-зависимой глюкозо-6-фосфатдегндрогеназы из пекарских дрожжей S.cerevisiae.
3а единицу активности NAD-киназы принимают количество фермента, ката1079 6 лиэирующего образование 1 мкмоль
NADP за 1 ч на 1 r - активизированной биомассы клеток (1 мкмоль NADP/1ч/1 r)
Сравнительные данные получения
NAD-кнназы по предлагаемому v. по известному способу
Из таблицы видно, что штамм Brevi"
bacterium stationis 1228 обладет более высокой метафосфатзависимой
NAD-киназной активностью по сравне-, нию с известным Brevibacterium ammoni
agenes JAM 1645.в 6,2-9,6 раза в кол- бах и 5-7 раз в ферментерах.
Формула изобретения
Способ культи- Активность NAD-киназы вирования 1/мкмоль NADP/1 ч/1 r
