Способ определения активности тканевого тромбопластина

 

Изобретение относится к медицине и касается способа определения активности тканевого тромбопластина Целью изобретения является упрощение способа за счет замены труднодоступных реактивов. Способ осуществляется путем инкубации плазмы с источником тромбопластина, определения времени свертывания плазмы и построения калибровочной кривой зависимости времени свертывания от количества тромбопластина В качестве контрольной пробы используют пулированную нормативную донорскую плазму, предварительно насыщенную неполным тромбопластином (коммерческим эритрофосфатидом) Способ позволяет исключить из определения апопротеин III, а также фактор IX-дефицитную плазму. 1 ил. 3 табл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УБЛИК (я)5 G 01 N 33/86

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ВМ60ВЯМ

1МИОЖ3- 7ЕЖМИМ1Л

ЬИБ,ЛИОТЕг(А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

0 (Л

СО

О

О 4

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4487880/14 (22) 14.07.88 (46) 23,06.91. Бюл. N 23 (71) Тюменский государственный медицинский институт (72) А.Ш,Бышевский, П.И.Левен. О.А.Терсенов, Е,B,Ïëàòoíoâ и И.А,Дементьева (53) 612.115.2 (088.8) (56) Thromb. Haemost, (Stut.), 1982, ч. 48, N 1, р. 54-58. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ТКАНЕ ВОГО ТРОМБОПЛАСТИНА (57) Изобретение относится к медицине и касается способа определения активности тканевого тромбопластина. Целью изобреИзобретение относится к медицине. а именно к биохимии, и касается способа определения тканевого тромбопластина.

Цель изобретения — упрощение способа эа счет замены труднодоступных реактивов.

На чертеже показан график для иллюстрации предлагаемого способа.

Пример 1. 1. Из 100 мг сырой ткани печени крысы получают гомогенат иэмельчением навески в гомогенизаторе стеклостекло со скоростью 3000 об/мин, 5 мин в присутствии 1 мл 0,14 М раствора хлорида натрия. Гомогенат центрифугируют при ускорении 400 х о.10 мин, надосадок центрифугируют с ускорением 145000 х g 60 мин, супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 10 мл 0,14 М раствора хлорида натрия и повторяют центрифугирование, Надосадок отбрасывают. а осадок ресуспендируют в 10 мл того же растворителя (взвесь тканевого тромбопластина).

„„5U 1658097 А1 тения является упрощение способа за счет замены труднодоступных реактивов.

Способ осуществляется путем инкубации плазмы с источником тромбопластина, определения времени свертывания плазмы и построения калибровочной кривой зависимости времени свертывания от количества тромбопластина, В качестве контрольной пробы используют пулированную нормативную донорскую плазму, предварительно насыщенную неполным тромбопластином (коммерческим эритрофосфатидом). Способ пОзволяет исключить из определения апопротеин III, а также фактор IX-дефицитную плазму, 1 ил. 3 табл.

2, К0.1 мл пулированной донорской плазмы (от четырех доноров) добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мгlмл). 0,1 мл

0,14 М раствора хлористого натрия и 0,1 мл

0,025 М раствора хлорида кальция — определяют время свертывания (Т,), которое оказалось равным 103 с.

3. К 0,1 мл той же пулированной плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл), 0.1 мл взвеси тканевого тромбопластина и 0,1 мл 0.025 М раствора хло рида кальция — определяют время свертывания (T0) — оно оказалось равным 22 с. Отношение

Тк/Т оказалось равным 4,68, что выпадает иэ интервала 2 — 4, В связи с этим исходную взвесь тканевого тромбопластина разбавляют в 10 и 100 раз, проводят определения согласно п. 3 с обоими разведениями и устанавливают. что время свертывания равно

49 и 85 с соответственно для разведения в

10 и 100 раз, 103/49 и 103/85 равны соответственно 2,1 и 1,2. Первое значение лежит

1658097 в интервале от 2 до 4 и используется для расчета.

Расчет: на графике находят, что значению Т,/Т, равному 2,1, соответствует активность тканевого тромбопластина в пробе, равная 1,05 ЕА. Умножают эту величину на 10 (приведение к 1 мл) и на 100 (разведение осадка в 10 и еще раэ в 10 раэ), а также на 10 (приведенные к 1 г сырой ткани).

Результат — 10500 ЕА/г сырого вещества, Пример 2, 1, Навеску ткани легких крысы помещают в гомогениэатор стеклостекло и измельчают (3000 об/мин, 5 мин) в присутствии 1 мл 0,14 M раствора хлористого натрия. Гомогенат центрифугируют 10 мин с ускорением 400 х g, отделяют надосадок и центрифугируют его 60 мин с ускорением 145000 х g, отбрасывают надосадок, суспендируют осадок в 10 мл 0,14 М раствора хлористого натрия, повторно центрифугируют в тех же условиях, отбрасывают надосадок, а осадок ресуспендируют в 10 мл того же растворителя (взвесь тканевого тромбопластина).

2. К 0,1 мл пулированной донорской плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл), 0,1 мл 0,14 М раствора хлористого натрия и 0,1 мл 0,025 M раствора хлорида кальция — определяют время свертывания (Т ) 96 с.

3. К 0,1 мл пулированной плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл), 0,1 мл взвеси тканевого тромбопластина (иэ. п.1) и 0 1 мл 0,025 M раствора хлорида кальция — определяют время свертывания (Т ) 27 с. Отношение

Т /Т = 3,43, т.е. располагается в интервале между 2 и 4, следовательно, используется для расчета.

Расчет с помощью калибровочного графика показывает, что величина 3,4 (отношение Тк!Т ) соответствует 2,2 ЕА. Умножив это значение на 10 (приведение к 1 мл) и на

100(10 — приведение к 1 г сырого вещества, 10 — разведение исходного вещества), получают 2200 EA/г сырого вещества.

Воспроизводимость определений (о /M x х 100) при 10 повторностях составляет 4,27,, Конкретно для 10 параллельных определений активности тканевого тромбопластиHà

5 в ткани печени средняя величина равна

10210 ЕА/г сырой ткани (о) — 428,8.

В табл.1 показана сравнительная характеристика трудоемкости получения некоторых реактивов, используемых в предлагаемом

10 и известном способах, В табл.2 показана сравнительная характеристика материалов и аппаратуры, используемая в известном и предлагаемом способах.

15 В табл,3 показана тромбопластическая активность ткани мозга человека в условных единицах активности (ЕА) на 1 г сырой ткани.

Иэ данных табл.3 видно, что результаты, полученные с помощью предлагаемого спо20 соба, в достаточно концентрированных материалах не уступают по воспроизводимости и чувствительности результатам, полученным с помощью известного способа, При сильном разбавлении (1:20) воспроизводимость да25 же несколько выше в случае использования предлагаемого способа — отклонение от М уменьшено с 12,5 (известный) до 11,5 (предлагаемый).

Предлагаемый способ позволяет эаме30 нить апопротеин 1И, а также фактор IX-дефицитную плазму, для получения которой необходимо располагать больными с дефицитом этого фактора.

Формула изобретения

35 Способ определения активности тканевого тромбопластина путем инкубации плазмы с источником тромбопластина в опытной и контрольной пробах, определения времени рекальцификации плазмы и

40 построения калибровочной кривой зависимости времени рекальцификации от количества тромбопластина, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа эа счет замены труднодоступных реактивов, в каче45 стве контрольной пробы используют нормальную донорскую плазму, насыщенную эритрофосфатидом.

1658097

Таблица 1

Этапы определений п е лагаемого известного

0,5 ч

0,5 ч

Отсутствует

Измельчение исследуемого материала

Солюбилизация и отделение надмолекулярных частиц

Освобождение надмолекулярных частиц от примесей (отмывание)

Диализ и хроматография

Выделение фосфолипидов

Рекомбинация тканевого тромбопластина

О енка активности тканевого т омбопластина

8ч

Отсутствует

7ч

48ч

1ч

10 мин

4ч

Отсутствует

30 мин

4ч 50 мин

64 ч 40 мин

Итого:

Таблица 2

М

n/n и редлагаемого известного

Материалов 5, Единиц аппаратуры — 3

Итого:

Материалы—

13 наименований, из них 5 труднодоступных, (8-10, 12 и13)

Единиц аппаа ы7

2

4

6

7, 8

11

12

13

14

16

17

18

19

Материалы и аппаратура

Исследуемая ткань

Вероналовый буфер

Натрия дезоксихолат

Трис-буфер

Натрия хлорид

Кальция хлорид

Тритон X 100

Сефадекс ДЭАЭ-А50

Ультрагель АсА44

Амикон PM-10

Растворители органические

Фактор-IX дефицитная плазма

Коммерческий тромбопластин

Эритрофосфатид коммерческий

Микрораэмельчитель тканей

Центрифуга лабораторная

Ультрацентрифуга

Диализатор

Наборы для колоночной хроматографии

Роторный испаритель

Гене ато льт азв ка

Показатели ля способа

Ха акте истика я способа

1658097

Таблица 3 олаи дюж а оп оотг ара

®Ж. ФРоибоаласмона, ма/рм

Составитель С.Мельникова

Редактор А.Коэориэ Техред M. Моргентал Корректор Т,Палий

Заказ 1712 Тираж 420 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб,. 4/5

Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101