Штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент капсульного антигена фракция 1 чумного микроба

 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению капсульного антигена фракция I чумного микроба. Цель изобретения - получение штамма Escherichja coll, продуцирующего капсульный антиген фракция I чумного микроба. Для этого штамм Е. coll K802 трансформирован сконструированной генно-инженерными методами рекомбинантной плазмидой р AF-10-23, содержащей репликон векторной молекулы рАТ153 и фрагмент ДНК (размером 99 т.п.н.) плазмиды чумного микроба pFra. В результате получен штамм, способный продуцировать капсульный антиген фракция I, секретируя его в среду культивирования. Продукция антигена фракция I определяется в реакции пассивной гемагглютинации с чумным эритроцитарным моноклона л ьн ы м к этому антигену иммуноглобулиновым диагностикумом.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ сОцИАлистических

P ЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

И63НИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21). 4789306/13 (22) 09.02.90 (46) 30.09.91, Бюл. М 36 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) О. А. Кириллина, Ю. А, Попов, О. Г. Шишкина и Е, Г, Булгакова (53) 616;988.27(088.8) (56) Биотехнология. T. 5, 1989, М 1, с. 9-14. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA

COLI — ПРОДУЦЕ НТ КАПСУЛ Ь НОГО АНТИГЕНА ФРАКЦИЯ I ЧУМНОГО МИКРОБА (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению капсульного антигена фракция I чумного микроба. Цель изобретения — получение штамма Escherlch a

coll, продуцирующего капсульный антиген

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению капсульного антигена фракция! чумного микроба, В настоящее время в качестве продуцента капсульного антигена фракция 1 используют штамм Yersinla pestls EV линии

НИИЭГ. Однако известный штамм, продуцирующий капсульный антиген фракция 1 (Ф1), требует специальных условий работы в соответствии с требованиями противозпидемического режима и обладает невысокой скоростью роста.

Цель изобретения — получение штамма

Escherlchla coll, продуцирующего капсульный антиген фракция I чумного микроба.

Штамм Escherlchia coll KM13 pAF10-23 создан путем введения в клетки исходного штамма Escherichia coll К802 рекомбинантной плазмиды pAF10-23, сконструированной.5Ы „1680768 А1 фракция I чумного микроба. Для этого штамм Е. coll К802 трансформирован сконструированной генно-инженерными методами рекомбинантной плаэмидой р

AF 10-23, содержащей репликон векторной молекулы рАТ153 и фрагмент ДНК (раэмером 99 т.п.н.) плазмиды чумного микроба pFra, В результате получен штамм, способный продуцировать капсульный антиген фракция I, секретируя его в среду культивирования. Продукция антигена фракция определяется в реакции пассивной гемагглютинации с чумным эритроцитарным моноклональным к этому антигену иммуноглобулиновым диагност икумом. генно-инженерными методами и состоящей из векторной плазмиды рАТ153 и фрагмен- 0, та ДНК плазмиды чумного микроба pFra (99 т.п,н.), кодирующей синтез антигена Ф1 и "мышиного" токсина. Клонированный фрагмент размером 5,4 т.п.н.имеет в своем составе ген, детерминирующий продукцию 0 капсульного антигена Ф1. 00

Штамм депонирован в музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (Саратов) под номером КМ13, Штамм характеризуется следующими признаками, Культурально-морфологические признаки, Прямые или слегка изогнутые палочки длиной 2,0 — 6,0 мкм, шириной 1,1 — 1,5 мкм.

При электронно-микроскопическом исследовании на отдельных клетках регистриру1680768 ется сохранившаяся рыхлая капсула толщиной 1,0 — 1,4 мкм, На твердых питательных средах формирует типичные для кишечной палочки гладкие, круглые, белые, непрозрачные колонии. При посеве в питательный бульон вызывает равномерное помутнение этой среды. Растет на простых питательных средах с добавлением ампициллина 50 мкг/мл (селективный маркер).

Физико-биохимические свойства. Факультативный анаэроб, Температура оптимального роста 37 С. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, мальтозу, маннозу. Не ферментирует сахарозу, лактозу, маннит.

Продуцирует капсульный антиген чумного микроба фракция 1, секретируя его в среду культивирования.

Пример 1, Готовят одномиллиардную взвесь в физиологическом растворе суточных агаровых культур Escherlchla coli MK13

pAF10-23, Escherlchla coli К802, Yerslnia

pestis EV. По 0,1 мл культуральных взвесей каждого штамма засевают в 5 мл бульона

Хоттингера (для опытного штамма с добавлением 50 мкг/мл ампициллина). выращивают при 37 С в течение 18 ч с аэрацией.

При этом титр клеток в бульонной культуре штамма Y. pestis EV составляет 2,5х10 м.к./мл, б

° и для штамма Е. coll KM13 pAF-23

9х10 м.к,/мл, После осаждения клеток центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин супернатанты исследуют в реакции пассивной гемагглютинации с чумным эритроцитарным моноклональным к фракции иммуноглобулиновым диагностикумом (производство Среднеазиатского ПЧИ).

Для количественного определения капсульного антигена фракция в культуральной среде и определения чувствительности метода используют препарат антигена Ф1 из набора "Тест-система иммуноферментная моноклональная для идентификации антигена Ф1 возбудителя чумы" (производство Среднеазиатского ПЧИ).

Исследуемые супернатанты и раствор антигена Ф1 титруют по 0,2 мл в 0,2 мл раствора Твин-20 (разведение 1:50000) в полистироловых плашках для постановки серологических реакций. Результаты реакции учитывают через 3 ч, Супернатант опытного штамма Е. coll KM13 pAF-23 реагирует до титра 1:64 — 1:128; супернатант штамма Y.

pestis ЕЧ вЂ” до титра 1,2-1:4; супернатант штамма E. coll К802 (рАТ153 (исходный штамм-реципиент с векторной плазмидой) не вызывает склеивания эритроцитов ни в одном из разведений.

Чувствительность метода в данной серии опытов составляет 0.00305 мкг антигена

Ф1 на 1 мл, Штамма Escherlchla coli KM13

pAF10-23 продуцирует 0,097 — 0.195 мкг ан5 тигена Ф1 на 1 мл культуральной среды, штамм Yerslnia pestls EV — 0,0061—

0,0122 мкг/мл, штамм Escherlchla coll К802 рАТ153 не продуцирует антиген Ф1.

Результаты опыта показывают, что в

10 укаэанных условиях роста (полноценная питательная среда, аэрация, оптимальная для биосинтеза антигена Ф1 температура 37 С) штамм Е. coll KM13 pAF-23 обладает значительной скоростью роста, в процесе кото15 рого в его клетках синтезируется антиген

Ф1 чумного микроба. Штамм Yersinla pestls

EV линии НИИЭГ не дает прироста биомассы за 18 ч инкубации в тех же условиях и вследствие этого проявляет низкий уровень

20 продукции антигена Ф1, в 8 — 16 раз меньший, чем у штамма Escherichia coli КМ13

pAF10-23.

Пример 2, В 250 мл бульона (В (10 г бакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экс25 тракта, 10 г NaCl на 1 л, рН 7,2) вносят по 0,1 мл приготовленных по прежней схеме одномиллиардных взвесей клеток штаммов

Е scherlchia coli KM13pAF-23, Escherlchla

coll К802 рАТ153, Yerslnla pestis EV, 30 Для опытного штамма в среду роста добавляют 50 мкг/мл ампициллина. Все штаммы выращивают при 37 С с аэрацией в течение 42 ч. Титр клеток штамма чумного микроба возрастает с 4,0х10 до

35 3,6х10 м,к./мл, титр клеток штаммов ки7 шечной палочки — с 4,0х10 до 2,8х10 м.к./мл.

5 в

Результаты РПГА, поставленной в условиях, аналогичных примеру 1, следующие: супернатант опытного штамма Е. соП

40 KM13pAF-23 реагирует до титра 1:132272; супернатант штамма Y, pestis EV — до титра 1:2048; супернатант штамма Е. coll

К802 рАТ153 не дает реакции, Следовательно, клетки штамма Е.coli KM13

45 pAF10-23 продуцируют в указанных условиях роста в течение 42 ч внеклеточно 399,77 мкг/мл антигена Ф1 чумного микроба, т.е. в

64 раза больше, чем клетки штамма Y. pestls

EV (6,25 мкг/мл). При этом титр клеток

50 штамма Е. coli KM13 pAF-23 возрастает в

7х10 оаз, титр клеток штамма Y, pestis EV — в 10 раз.

Таким образом, получен штамм

Escherichia coll KM13pAF-23, безопас55 ный в противоэпидемическом отношении, продуцент капсульного антигена фракция

I чумного микроба, секретируемого в культуральную среду. Кроме того, штамм является базовым для конструирования штамма-суперпродуцента капсульного ан168076В

Формула изобретения

Составитель Ю.Попов

Тех ред M. Ìîðãåíòàë Корректор О.Ципле

Редактор М.Петрова

Заказ 3286 Тираж 360 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тигена Ф1, а также рекомендуется в качестве модельного при решении различных теоретических вопросов, связанных с регуляцией экспрессии антигена фракция чумного микроба.

Штамм бактерий Escherlchlа coll

КМ13 — продуцент капсульного антигена

5 фракция чумного микроба.