Способ видовой идентификации л-форм микобактерий

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к прямому определению видовой принадлежности (идентификации ) Л-форм микобактерий, и может быть использовано для диагностики Л-форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, а также атипичных Л-форм микобактерий . Цель изобретения - ускорение способа. Для этого гомогенат исследуемого материала высевают на питательную среду, содержащую, мас.%: Л-аспарагин 0,41- 0,56; лимоннокислый натрий 0,35-0,475; сернокислый магний 0,05-0,07; лимоннокислое аммиачное железо 0,005-0,007; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,026-0,035; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,25-0,335; глицерин 7,44- 10,28; бромтимоловый синий в 1 мл 0,1 н. раствора едкого натрия рН 7,2-7,6 0,003- 0,005; сыворотка крови крупного рогатого скота 10: дистиллированная вода остальное. После инкубирования отделяют биомассу Л- форм центрифугированием, промывают физиологическим раствором в течение 10-15 мин, центрифугируют при 2,5-3,0 тыс. об/мин. С выделенной ДНК Л-форм проводят реакцию перекрестной ДНК-ДНК гибридизации и по гомологичности ДНК Л-форм определенному виду ДНК микобактерий идентифицируют Л-формы. Ё

союз сонетских социалистических

РЕСПУБЛИК, „„5U„„1687605 А1 (51)5 С 12 N 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. g)pl@ (г, бg $ QQ

Д;, j 1 sit 13 Л1 (Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к прямому определению видовой принадлежности (идентификации) Л-форм микобактерий, и можетбыть использовано для диагностики Л-форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, а также атипичных Л-форм микобрактерий.

Известен способ определения видовой принадлежности Л-форм микобактерий, заключающийся в следующем. Из патологического материала животного или человека после предварительной обработки материала серной кигчотой проводят культуральный посев на полужидкую питательную (21) 4679368/13 (22) 17.04.89 (46) 30.10.91. Бюл. М 40 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институх экспериментальной ветеринарии им. Я.P.Êîâàëåíêî (72) Е.А.Асташова, А.И.Кадочкин, Б.A.Ôîмин, С.К.Артюшин и Я.А.Бортюк (53) 576.7.093.1 (088.8) (56) Дорожкова И,Р. и совет. Выделение

Л-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала. Методические рекомендации. M., МЗ СССР, 1984. (54) СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ Л-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к прямому определению видовой принадлежности (идентификации) Л-форм микобактерий, и может быть использовано для диагностики Л-форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, а также атипичных Л-форм микобактерий. Цель изобретения — ускорение способа. Для этого гомогенат исследуемого материала высевают на питательную среду, содержащую, мас. : Л-аспарагин 0,410,56; лимоннокислый натрий 0,35 — 0,475; сернокислый магний 0,05 — 0,07; лимоннокислое аммиачное железо 0,005 — 0,007; фосфорнокислый одноэамещенный калий

0,026 — 0,035; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,25-0,335; глицерин 7,4410,28; бромтимоловый синий в 1 мл 0,1 н, раствора едкого натрия рН 7,2-7,6 0,0030,005, сыворотка крови крупного рогатого скота 10; дистиллированная вода остальное

После инкубирования отделяют биомассу Лформ центрифугированием, промывают физиологическим раствором в течение 10-15 мин, центрифугируют при 2,5-3,0 тыс. об/мин. С выделенной,ДНК Л-форм проводят, реакцию перекрестной ДН К-ДНК гибридиэации и по гомологичности ДНК Л-форм определенному виду ДНК микобактерий идентифицируют Л-формы.

00 среду (модификация основы полужидкой— казеиновой среды Школьникавой), которая 0 содержит, г/л: фосфорнокислый однозамещенный калий 1,5; фосфорнокислый двуза- Ц1 мещенный натрий 2,5; сернокислый магний

0,5; лимоннокислый натрий 1,5; лимоннокислое аммиачное железо 0,05; аспарагин

1,0; глицерин 30 мл; агар-агар 3,0; дистиллированная вода остальное, и добавки к 1 л среды: сахароза 286,0; сыворотка крови крупного рогатого скота 143 мл; стрептоми-, цин 1 — 5 тыс.ед.; пенициллин 1-5 тыс. ед„ раствор Люголя 5 мл.

На указанной полужидкой среде культивируют посевной материал при 37"С в тече168 7605

10 ние 1-1,5 мес и после предварительного тестирования Л-форм микобактерий методом фаэово-контрастной микроскопии проводят реверсию полученной культуры

Л-форм микобактерий методом культурального пассажа (3-5 и более, каждый последующий пассаж проводят на свежеприготовленную питательную среду, длительность одного пассажа 1-1,5 мес), параллельно проводят пассажи также на морских свинках (3 — 5 и более, на каждый пассаж используют трех животных, длительность одного пассажа 3 мес). Получают в среднем через 9-12 мес из исходной культуры микобактерий в Л-форме их ревертанты в бактериальной форме, определяют видовую принадлежность ревертантов с помощью применения общепринятых культуральных, тинкториальных и биохимических методов исследования, после чего проводят учет результата — определение видовой принадлежности изучаемых Л-форм микобактерий по полученной видовой принадлежности их бактериальных ревертантов.

Однако реализация известного способа требует затраты длительного времени от начала способа до получения результата, Цель изобретения — ускорение способа, Пример 1. Обрабатывают патологоанатомический материал от подопытного теленка, производят посев гомогенизированного материала (смешанного с физиологическим раствором в соотношении 1/3) по

0,2 мл в приготовленные емкости с 50 мл предлагаемой питательной среды следующего состава, мас.7. Л-аспарагин 0,41; лимоннокислый натрий 0,35; сернокислый магний 0,05; лимоннокислое аммиачное железо 0,005; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,026; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,25; глицерин

7,44; бромтимоловый синий 0,003 в 1 мл

0,1н. стандартного раствора едкого натрия (рН 7,6); сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное, Культивируют посевной материал при

37 С в течение 1 мес, проводят тестирование Л-форм микобактерий в нативных мазках методом фаэово-контрастной микроскопии, которое показывает на ичие

Л-культуры микобактерий и ее чистоту (отсутствие бактериальных форм микобактерий показали также общепринятые контроли). Далее изолируют Л-культуру микобактерий из жидкой среды центрифугированием при 2,5 тыс. об/мин в течение 10 мин, биомассу Jl-форм трехкратно отмывают физиологическим раствором в соотноше15

55 нии 1/50, центрифугируя при 2.5 тыс, об/мин по 10 мин. Иэ полученного осадка культуральной биомассы (0,45 г) выделяют

ДНК Л-форм микобактерий, после чего проводят реакцию перекрестной ДНК-ДНК гибридизации. Конечный результат реакции перекрестной ДНК-ДНК гибридизации показывает, что ДНК исследуемых Л-форм микобактерий гомологична ДНК М. bovls.

Таким образом, изучаемая Л-культура принадлежит к виду М. bovis.

Пример 2, Аналогично примеру 1 обрабатывают патолого-анатомический материал от другого подопытного теленка, проводят соответственный посев на предлагаемую среду следующего состава, мас. :

Л-аспарагин 0,48; лимоннокислый натрий

0,408; сернокислый магний 0,06; лимоннокислое аммиачное железо 0,006; фосфорнокислый одноэамещенный калий 0,03; фосфорнокислый двузамещенный натрий

0,288; глицерин 8,64; бромтимоловый синий

0,004 в 1 мл 0,1 н, стандартного раствора едкого натрия (рН 7,4); сыворотка крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное. Культивируют посевной материал в течение 1,2 мес, после тестирования центрифугируют с отмыванием осадка Jlкультуры при 2,7 тыс, об/мин по 12 мин.

Получают 0,7 г нативной биомассы Л-форм микобактерий, Далее, выделив ДНК Л-форм микобактерий, проводят реакцию ДН К-ДН К перекрестной гибридизации, которая показывает, что ДНК исследуемой Л-культуры гомологична ДНК М, bovis, и учет результата. Изучаемая культура Л-форм микобактерий является Л-формой M.bovls.

Пример 3. Аналогично приведенным примерам проводят посев патолого-анатомического материала от третьего теленка (из соответствующего опыта) на предлагаемую среду следующего состава, мас.7,:

Л-аспарагин 0,56; лимоннокислый натрий

0,475; сернокислый магний 0,07; лимоннокислое аммиачное железо 0,007; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,035; фосфорнокислый двузамещенный натрий

0,335; глицерин 10,28, бромтимоловый синий 0,005 в 1 мл 0,1 н. стандартного раствора едкого натрия (рН 7,2); сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное. Культивируют посевной материал в течение 1,5 мес, тестируют, центрифугируют при 3,0 тыс, об/мин по 15 мин, Получают 0,5 г нативной биомассы Л-форм микобактерий. Далее, выделив из нативной биомассы культуры ДНК

Л-форм микобактерий, проводят реакцию

1687605 перекрестной ДНК-ДНК гибридизации и учет результата. Изучаемая культура Лформ является Л-формой М.bovis, Предлагаемый способ позволяет ускорить идентификацию Л-форм, Формула изобретения

Составитель Г. Смирнова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор В. Гирняк

Редактор М. Петрова

Заказ 3678 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ видовой идентификации Л-форм микобактерий путем взятия материала от животных, обработки его серной кислотой, посева на питательную среду, содержащую

Л-аспарагин, лимоннокислый натрий, сернокислый магний, лимоннокислое аммиачное железо, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, глицерин, индикатор, сыворотку крови крупного рогатого скота и дистиллированную воду, инкубирования посевов с последующим тестированием и учетом результатов, отл ича ю щи и ся тем,что,с целью ускорения способа, питательная среда в качестве индикатора содержит раствор бромтимолового синего в 1 мл 0,1 н. раствора едкого натрия рН 7,2 — 7,6 при следующем количественном соотношении компонентов, мас, :

Л-аспарагин 0.41-0,56

Лимоннокислый натрий 0,35 — 0,475

Сернокислый магний 0,05 — 0,07

Лимоннокислое амми5 ачное железо 0,005 — 0,007

Фосфорнокислый однозамещенный калий 0,026 — 0,035

Фосфорнокислый двуэамещенный натрий 0,25-0,335

10 Глицерин 7,44-10,28

Бромтимоловый синий в 1 мл 0,1 н, раствора едкого натрия рН 7,2 — 7,6 0,003 — 0,005

15 Сыворотка крови крупного рогатого скота 10

Дистиллированная вода Остальное после инкубирования отделяют биомассу

20 Л-форм центрифугированием, промывают физиологическим раствором в течение 1015 мин центрифугированием при 2,5-3,0 тыс. об/мин, а тестирование и учет результатов осуществляют с помощью реакции пе25 рекрестной ДНК-ДНК гибридизации по гомологичности ДНК Л-форм микобактерий определенному виду ДНК микобактерий.