Способ диагностики аллергии

 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для выявления причинно-значимых аллергенов у больных с аллергическими заболеваниями. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа. Для осуществления способа по 0,15 мл гранулоцитов периферической крови в концентрации 2 -10 /мл вносят в опытную и контрольную пробирки. В опытную пробирку вносят аллерген, в контрольную - раствор Хенкса. Через 30 с обе пробы окрашивают флуоресцентным кальциевым красителем квином-2, а затем измеряют интенсивность флуоресценции клеток в контрольной и опытной пробах с помощью проточного цитофлуотиметра. Сравнивают координаты средней точки гистограмм, полученных в контрольной и опытной пробах, и при смещении средней точки гистограммы опытной пробы вправо по оси абсцисс по сравнению с контрольной на 10% и более диагностируют аллергию к данному аллергену . сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N ЗЗ/533

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4604078/14 (22) 09,11.88 (46) 15.11.91. Бюл. N 42 (71) Ленинградский педиатрический медицинский институт (72) И.M.Âîðoíöîâ, M.À.ÊèðèëëîD, Е,С,Нишева и Ю,M,Ðîçàíîâ (53) 615.373 (088.8) (56) Чучалин А.Г., Бражникова Н,А„Новиков

Ю.К., Трескунова В.В., Коркина Л.Г, Флуоресцентный зонд — в оценке функционального состояния лимфоцитов — Советская медицина, 1985, N. 10, с.28 — 30. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для выявления причинно-значимых аллергенов у больных с аллергическими заболеваниями. Цель изоИзобретение относится к медицине, в частности к аллергологии.

Цель изобретения — повышение точности и ускорения способа.

Способ осуществляют следующим образом.

У больного берут кровь из пальца или из вены в гепаринизированную пробирку(количество крови зависит от того, на какое количество аллергенов необходимо определить реакцию — для определения реакции нк

1 аллерген достаточно 0,5 мл крови). Пробирку с кровью оставляют при комнатной температуре на 45 мин под углом 45 и еще на 45 мин в вертикальном положении для расслоения крови на плазму с лейкоцитами и осадок эритроцитов, После отстаивания . плазму с лейкоцитами собирают в отдельную пробирку и наслаивают ее на градиент плотности фиколл-верографин 1,077. центбретения — повышение точности и ускарение способа. Дпя осуществления способа по

0,15 мл гранулоцитов периферической крови в концентрации 2.10 /мп вносят в опытную и контрольную пробирки. В опытную пробирку вносят аллерген, в контрольную-раствор Хенкса. Через 30 с обе пробы окрашивают флуоресцентным кальциевым красителем каином-2, а затем измеряют интенсивность флуоресценции клеток в контрольной и опытной пробах с помощью проточного цитофлуотиметра. Сравнивают координаты средней точки гистограмм, полученных в контрольной и опытной пробах, и при смещении средней точки гистограммы опытной пробы вправо по оси абсцисс по сравнению с контрольной на 10 Я, и более диагностируют аллергию к данному алпергену. рифугируют пробирку 30 мин при 300 g npu комнатной температуре. После центрифугирования на градиенте плотности образуется кольцо лимфоцитов, его снимают и используют для других целей, а осадок, содержащий гранулоциты с небольшой примесью эритроцитов, трижды промывают раствором Хен кса (т,е. центрифугируют 15 мин при

300 ц) и ресуспендируют гранулоциты в растворе Хенкса до концентрации 2 10/мл, Клетки разносят по 0,15 мл в 2 пробирки— контрольную и опытную. В контрольную пробирку добавляют 0,05 мл раствора Хенкса, а в опытную 0,05 мл аллергена, растворенного на растворе Хенкса до концентрации 2000 PNU/Mn (конечная концентрация аллергена в суспенэии гранулоцитов таким образом составляет 500

PNU/мл. Через 30 с после внесения раствора Хенкса и аллергена в опытную и конт1б91751

40 рольную группу пробиркидобавляют по 2 мкл раствора квина-2 в концентрации 500 ММ, а конечная концентрация краски в растворе составляет 5 ММ. Контрольную и опытную пробирки инкубируют в термостате при

37 С в течение 30 мин, По окончании срока инкубации измеряют интенсивность флуоресценции не менее 10000 клеток в контрольной и опытной пробирках с помощью проточного цитофлуориметра и возбуждение люминесценции проводят лучами с il, =

340 н л, регистрируя люминесценцию в области спектра 490 нм, Получа1от гистограммы, где по оси ординат обозначено количество клеток, а по оси абсцисс — интенсивность свечения. Полученные гистограммы Обрабатыва!от с помощью стандартной измерительной программы %/Y2 фирмы

KontolI Btldapalyse или любой аналогичной программе, С помощью этой программы на каждой гистограмме определяют координаты средней точки. Сравнивают координаты средней точки контрольной и опытной гистограмм и при смещении средней точки гистограммы опытной пробы вправо по оси абсцисс по сравнению с контрольной на

10% и более диагностируют аллергию к данному аллергену.

Пример 1. Миша А., 8 мес., поступил в больницу сдиагноэом "Распространенная экзема", Болен с 4 мес., когда после введения прикормов (каши на коровьем молоке и овощные пюре) появились экзематозные проявления на щеках и на лбу, распространившиеся впоследствии по всему телу. Кожные и провокационные пробы с пищевыми аллергенами не проводились из-за тяжелого состояния ребенка и обширности кожных поражений.

С помощью предлагаемого способа исследованы реакции гранулоцитов больного на аллерганы коровьего молока, пшеницы, картофеля, капусты, моркови, белка куриного яйца, трески, хека, Получено смещение средних точек гистограмм oI.I раво по оси абсцисс с аллергеном коровьего молока на 10%, аллергена пшеницы на

16%, аллергена моркови на 19%. С остальными аллергенами пробы были отрицательными (смещение средней точки гистограммы на 0 — 9%); По результатам лабораторных проб с помощь.о предлагаемого способа диагностирована аллергия к коровьему молоку, манной каше (пшеница), моркови. Исключение этих продуктов издиеты ребенка уже через 3 недели привело к очищению кожных покровов и улучшению общего состояния ребенка. Провокационпробы с коровьим молоком, MaHHQA кашсй и морковным соком были реэкоположительными, что проявлялось в обострении экземы и ухудшении общего состояния ребенка. Это подтвердило правильность диагностики с помощью предлагаемого способа.

Пример 2. Таня О., 12 лет, поступила в больницу с жалобами на зуд век, слезотечение, светобоязнь, насморк, проявляющиеся в весеннее время года. Впервые эти симптомы отмечены в возрасте 9 лет весной во время прогулки в парке, Заподозрена пальцевая сенсибилиэация, но провести кожные и провокационные пробы не представлялось возможным, так как больная поступила в период обострения заболевания и в весеннее время года, когда пробы с пыльцевыми аллергенами не проводятся. С помощью метода, изложенного в известном способе, исследованы реакции лимфоцитов периферической крови с аллергенами березы, ольхи, лещины. Получена слабоположительная реакция с аллергеном ольхи, с остальными аллергенами пробы были отрицательными, С помощью предлагаемого способа изучены реакции гранулоцитов больной на аллергены березы, ольхи, лещины, тимофеевки, овсянницы, paArpaca, лисохвоста, полыни, лебеды, амброзии.

Получено смещение средних точек гистограмм проб с аллергеном ольхи (на 34%), пыльцы березы (на 52%) и лещины (на 29%).

Больная девочка повторно поступила в больницу зимой следующего года, были проведены кожные пробы с пыльцевыми аллергенами, которые были резкоположительными с аллергенами пыльцы березы, ольхи и лещины, что подтверждает правильность диагностики.

Изобретение позволяет обеспечить высокую точность диагностики аллергии (на

50% выше по сравнению с прототипом), что в 15 раз уменьшает количество необходимой для реакции крови, в 6 раз количество аллергена, в 2 раза продолжительность реакции.

Формула изобретения

Способ диагностики аллергии путем инкубации лейкоцитов периферической крови с аллергеном и измерения содержания кальция в клетках по интенсивности свечения в них флуоресцентного кальциевого красителя, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, из крови выделяют гранулоциты, в качестве красителя используют квин-2 в концентрации 500 ММ, а измерение интенсивности свечения ведут на проточном цитофлуориметре по гистограмме и при смещении сред1691751

Составитель Р.Гуменюк

Редактор Н.Федорова Техред М.Моргентал Корректор И.Муска

Заказ 3924 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ней точки гистограммы опытной пробы в сторону увеличения на 10 и более по оси интенсивности флуоресценции по сравнению с контрольной. содержащей растворитель. диагностируют аллергию к данному аллергену.