Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопряженной транскрипции/трансляции

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для препаративной экспрессии генов как в научных, так и в прикладных целях. Целью изобретения является повышение выхода продукта экспрессии гена в виде пептида или белка за счет увеличения срока работы бесклеточной системы сопряженной транскрипции/трансляции. Способ осуществляют в бесклеточной системе непрерывного действия, в которой используют внеклеточную систему сопряженной транскрипции/трансляции; генетический материал подают в систему в виде молекул ДНК; одновременно с непрерывным удалением продуктов трансляции из системы удаляют продукты транскрипции; в реакционной смеси непрерывно восстанавливают исходные концентрации низкомолекулярных веществ как аппарата трансляции, так и аппарата транскрипции. Возможна препэративная экспрессия практически любых генов в виде молекул ДНК. Способ может служить важным дополнением , а в некоторых случаях и альтернативой генноинженерным методам. Способ не требует специальной наработки матричных РНК. что значительно упрощает и удешевляет его в сравнении с известным способом препаративного синтеза пептидов и белков в бес клеточных системах трансляции непрерывного действия. 1 ил. Ё

я сь."СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PEСПУБЛИК (si>s С 07 К 1/02, С 12 P 21/02

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4618624/13 (22) 22.12.88 (46) 15.01.92. Бюл. N 2 (71) Институт белка АН СССР (72) В.И.Баранов, И.Ю,Морозов и А.С.Спирин (53) 575.224,2 (088.8) (56) Пратт Д.М. — В кн.: Транскрипция и трансляция. Методы, Пер. с англ. / под ред.

Хеймса и Хиггинса. — И.:Мир:1987, с.216.

Pratt et sI. — Nucl. Ас14. Res., 1981, v. 9, р 4459. (54) СПОСОБ ПРЕПАРАТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

СОП РЯЖЕ Н НОЙ ТРАН СКРИПЦИИ/ТРАНСЛЯЦИИ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для препаративной экспрессии генов как в научных, так и в прикладных целях. Целью изобретения является повышение выхода продукта экспрессии гена в виде пептида или белка за счет увеличения срока работы бесклеточной системы сопряИзобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам препаративной экспрессии генов In

vItro с использованием бесклеточных систем сопряженной транскрипции/трансляции. Преимущественной областью использования является препаративный синтез биологически активных пептидов и белков для научных и прикладных целей.

Целью изобретения является повышение выхода продукта экспрессии гена в виде пептида или белка Эа счет увеличения срока

„„59„„1705302 Al женной транскрипции/трансляции, Способ осуществляют в бесклеточной системе непрерывного действия, в которой используют бесклеточную систему сопряженной транскрипции/трансляции; генетический материал подают в систему в виде молекул

ДНК; одновременно с непрерывным удалением продуктов трансляции из системы удаляют продукты транскрипции; в реакционной смеси непрерывно восстанавливают исходные концентрации низкомолекулярных веществ как аппарата трансляции, так и аппарата транскрипции.

Возможна препаративная экспрессия практически любых генов в виде молекул ДНК.

Способ может служить важным дополнением, а в некоторых случаях и альтернативой генноинженерным методам, Способ не требует специальной наработки матричных

РНК, что значительно упрощает и удешевляет его в сравнении с известным способом препаративного синтеза пептидов и белков в бесклеточных системах трансляции непрерывного действия. 1 ил. работы бесклеточной системы сопряженной транскрипции/трансляции.

В бесклеточйой системе сопряженной транскрипции/трансляции с использованием генов в виде молекул ДНК осуществляют непрерывное удаление иэ реакционной смеси синтезированного продукта и ниэкомолекулярных продуктов функционирования систем транскрипции и трансляции в виде АМР, ADP, GDP, СОР, UDP, фосфатов и пирофосфатов, непрерывное восстановлеwe концентрации расходуемых низкомоле1705302 кулярных веществ как аппарата трансляции в виде аминокислот, ATP, GTP, так и аппарата транскрипции в виде АТР, 6ТР, СТР, UTP, регенерацию ATP, GTP, CTP, ЫР из образующихся AMP, ADP, GDP, CDP, UDP c последующим возвратом регенерированных компонентов в систему сопряженной транскрипции/трансляции.

Иэ прокариотических клеток готовят экстракт, содержащий все компоненты аппарата транскрипции и аппарата трансляции, но свободный от эндогенных мРНК и

ДНК. К экстракту добавляют низкомолекулярные компоненты транскрипции и транслящии (аминокислоты, АТР, GTP, UTP, СТР), а также ген в виде молекулы ДНК. Реакционную смесь вносят в резервуар, где и протекает процесс сопряженной транскрипции/трансляции. Для предотвращения остановки процесса из резервуара через полупроницаемую мембрану непрерывно отводят поодукты транскрипции (фосфата, ADP GDP, CDP, UDP) и трансляции (синтезированный полипептид, АМР, GDP, фосфаты и пирофосфаты). Одновреме: но в резервуар подают аминокислоты, ATP, GTP, CTP, UTP для восстановления их исходной концентрации. Синтезированный полипептид собирают на колонке со специфическим сорбвнтом, а продукты транскрипции и трансляции собирают в специальном резервуаре для их последующей регенерации. Способ обеспечивает препаративную экспрессию гвенов в виде молекул ДНК в течение десятков часов с выходом синтезированного продукта (полипептида) 50-200 мкг с 1 мл реакционной смеси.

Пример 1. Препаративная экспрессия генов плазмиды pUD 18 в бесклеточной системе.

Готовят стандартную бесклеточную систему сопряженной транскрипции/трансляции. Плазмида р0018 содержит гены 9-лактамазы и дигидрофолат редуктазы.

Раствор (А) содержит 55 мМ транс ацетат, рН 8,2, 11 r M MgAc, 9.5 мМ CaClz, 76 мМ КАс, 1,5 мМ ДТТ, 1,6 полиэтиленгликоля 6000, 5 мМ фосфоенолпирувата, 1,2 мМ

АТР, по 0.8 мМ GTP, CTP и UTP, 5 мкгlмл фолиевой кислоты, 100 мкМ (Н) лейцина с з удельной радиоактивностью 230 мКи/ммоль и 100 мкм каждой из остальных аминокислот. 1 мл реакционной смеси, приготовленной на буфере (А) содержит 430 мкл

55 зкс1ракта S30, 150 мкг плазмиды pUD 18, 200 мкг суммарной тРНК.

Стандартная система сопряженной транскрипции/трансляции за 40 мин инкубации при 37 С (платовое значение) синтезирует по 6 пикомолей /3-лактамазы и дигидрофолатредуктазы на 1 мл инкубационной смеси. В параллельном эксперименте в установке непрерывного действия к 1,0 мл реакционной смеси непрерывно подают раствор (А) со скоростью либо 3 мл/ч, либо

2 мл/ч, а продукты реакции отводят из реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтрационную мембрану XM-100.

Кинетика экспрессии генов Р-лактамазы и дигидрофолатредуктазы в такой системе представлена на рис.1. За 50 ч функционирования такой системы в 1 мл реакционной смеси синтезируют по 4,1 наномолей Р-лактамазы и дигидрофолатредуктазы, что соответствует 212 мкг белков /3-лактамазы и дигидрофолатредуктазы.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает препаративную экспрессию генов в бесклеточной системе, синтезируя более чем в 500 раэ больше продукта, чем это делает стандартная бесклеточная система сопряженной транскрипции/трансляции.

По предложенному техническому решению разработан лабораторный макет установки.

Формула изобретения

Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопряженной транскрипции/трансляции с использованием генов ДНК с последующей очисткой целевого продукта, отл ич а ю щи и ся тем, что. с целью повышения выхода продукта экспрессии гена в виде пептида или белка за счет увеличения срока действия системы, в процессе экспрессии иэ системы осуществляют непрерывное удаление целевого продукта и одновременно синтезируемых соединений транскрипции и трансляции в вире AMP, ADP, GDP, CDP, UDP, фосфатов и пирофосфатов, непрерывное восстановление концентрации расходуемых низкомолекулярных соединений как системы трансляции в виде аминокислот, АТР. GTP так и системы транскрипции в виде ATP, GTP, CTP, UTP, регенерацию ATP, GTP, CTP. UTP иэ образующихся AMP, ADP, GDP, CDP, UDP, с последующим возвратом регенерированных АТР, GTP, CTP, UTP в систему сопряженной транскрипции/трансляции.

1705302

t20

Фю

X

? х с

Ф

Ф з

? ф

4l

? о

Вреия

Составитель Н. Кузенкова

Редактор B. Трубченко Техред М.Моргентал Корректор М, Максимишинец

Заказ 168 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101