Способ выделения матриксного белка м1 ортомиксовирусов

 

Изобретение относится к биологии и медицине. Целью изобретения является получение нативного неаггрегировэнного мэтриксного белка М1 ортомиксовирусов типа А, В. Цель достигается поэтапной депротеинизацией вирионов с помощью неионного детергента при различных рН. На переом этапе депротеинизирующего воздействия при нейтральном рН получают вирусные нуклеоиды, содержащие белок М1. На втором этапе при обработке нуклеоидов в кислой среде с рН около 4,0 происходит селективная солюбилизэция М1 Таким образом , разработанный способ, лишенный денатурирующих воздействий, позволял получить в растворимом состоянии нативный белок М1 ортомикровирусов А, 3. Разработанный способ может иметь широкое применение в медицине при разработке диагнсстикумов и вакцинных препаратов и биологии для структурных и функциональных исследований белков и суОэ/русных структур. ел с

СОк; СОВЕ СКL"x

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)з С 12 N 7/00, А 61 К 39/00

ГОСУДАРCTBEHHblPl КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с1p ктур. (21) 4787627/ (22) 31,01,90 (46) 23.01 92. Бюл, N. 3 (71) Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского (72) О.П.Жирнов (53) 576.858 (088.8) (56) Gregorlades А. V:rotogy, 1973, ч.54, р.

369-383.

Охфого T S. aM Schlid G.Ñ. Virology, 1974. ч,74, р.394-402, (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МАТРИКСНОГО BEËt À М1 ОРТОМИКСОВИРУСОВ (57) Изобретение относится к биологии и медицине. Це ью изсгр=тения является получение нативно.о неаггрегированного матриксного белка М1 остомиксовирусов типа А, B. Цель достигается поэтапной деИзобретение относится к биологии, а именно вирусологии, и касается выделения матриксного белка М1 ортомиксовирусов.

Целью изобретения является получение нативного неагрегированного матриксного белка М1 ортомиксовирусов типов А, В.

Для достижения цели разработан прием поэтапной депротеинизации вирусов гриппа типов А, В и с помощью неионного детергента при различных рН, На первом этапе посредством воздействия детергента

s нейтральной среде (рН 6,8 — 8,0) осуществляют растворение липидной оболочки вирионов и удаление поверхностных гликопротеидов с сохранением внутреннего нуклеида. На втором этапе обработка полученного вирионного нуклеоида детергентом в кислой среде (рН 3 0 — 4,5) приводит к избирательной солюбилизации матриксно3 „„1707074 А1 протеинизацией вирионов с помощью неионного детергента при различных рН. На первом этапе депротеинизирующего воздействия при нейтральном рН получают вирусные нуклеоиды, содержа цие белок М1.

На втором этапе при обработке нуклеоидов в кислой среде с рН около 4,0 происходит селективная согюбилизация М1 Таким образом, разработанный способ, лишенный дснатурирующих воздействий, позволял получить в растворимом состоянии нативный белок М1 ортомикровирусов А, B. Разработанный способ может иметь широкое при 1енение в медицин при разр ботке диагнсстикумов и вакциннь!х препаратов i в биологии для структурных и 1ункциочагt> ньх ис"ледований белков и су5в. рчснь;х го белка М1, что делает возможным его получение после удаления вирусного рибонуклеопротеида (РНП). Такой способ выделения, лишенный какого-либо денатурирующего воздействия, исключает агрегацию М1 и позволяет получить его в нативном состоянии в растворимой форме.

Пример. Вирусы гриппа

А/ WS N /33(Н 1N1), А/A ichi /2/68(Н3 М2).

А/FPV/4Veybridge(H7N7), В/Lee/40, размножают в 9-дневных куриных эмбрионах при

36 С в течение 48 ч, кроме вирусов В/Lee!40, которые инкубируют 72 ч при 32 С. Вируссодержащую аллантоисную жидкость (А;К) разводят раствором Хзнкса до концентрации вируса 256-512 ГАЕ/мл и осветляют при

11000g 30 мин. Осветленную АЖ наслаивают на двухступенчатый градиент глицерина (8,5 мл вирусного материага на одну проб рку

1707074 градиента), в котором верхний спой(интерслой) состоит из 3,5 мл 10 -ного раствора глицерина, приготовленного на в-,де без ка « -либо добавок, а н1жний слои (базовый спой) состоит из 4,3 мл 20%-ного глицерина, содержащего 25-100 мМ NaCl, 20 трипсин

«нгибирующих единиц (ТИЕ) на 1 мл апро тинина (контрикал R, ГЕРМЕД-ГДР), 1% детергента нонидет P-40 (NP 40) и 5 мМ трис-гидроксиметиламинометана, доведенного до pH 6,8-8,0 морфолинэтансульфоновой кислотой (МЭС), либо гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновой кислотой (ГЭПЭС). Для выделения вирионных нуклеоидов градиенты центрифугируют при 20000 об/мин и при 15 — 18 С в роторе

S1A28.1 (Spinkb L-5). В ходе центрифугирования у вирионов при прохождении базового слоя происходит растворение наружной липопротеидной оболочки под действием детергента NP-40. B результате, солюбилизированные вирусные гликоRðoòåèäû задерживаются в глицерине, в нуклеоиды проходят базовый слой и оседают на дно пробирки.

После центрифугирования аккуратно у да чяют жидкую фазу градиентов и полученные осадки (вирусный нуклеоид) из 3 — 4 пробирок суспендируют в 350 мкл 10 -ного глицерина, содержащего 50 —. 200 MM JaCL

20 ТИЕ/мл апрот«н«на, и 0,1 — 0,5 (, NP-40, Полученную суспензио делят на части по 0". мкп, к которым добавчяют 10 — 30 мкп

Л фос4 атío(l а Нг О.;)-ци ратного

;) либо цитратного (С6НаОт . 7Na ) буфера с раз чичным pH B дидпдзс - 3,0 — 5,2. После пипетирования суспенэию наслаивают на 0,5 мл 20$-ного глицерина, приготовленного на воде, и центрифугируют в растворе ЯП65 при 23000 об/1 ин (12 С) в течение 1,5 — 2,0 ч (Spinko

L 5), После центрифугирования отбирают верхний слой в обьеме 120 — 150 мкл, удаляют 20 (,-ный глицерин и сохраняют осадок.

Качественную и количественную оценку полипептидного состава получечных фракций проводят на основании электрофореза белков в полиакриламидном гепе, содержащем додецил сульфат натрия с буферной системой Laemmli, После злектрофореза гели окрашивают Кумаси R-350 (pharmacla) и отмывают смесью уксусной кислоты (7;() с этанолом (5 (,) с последующим сканирова5

50 нием окрашенных гелей в видимом свете на спектрофотоме-ре Beckman CDS-200.

Далее прс водят второе фракционирсвание, flppl котором препарат Hóêëåñ«äa суc пендируют в 10 (,-но м глицерине. содержащем фосфатно-цитратный либо центратный буфер с различным рН в диапазоне 3,0 — 6,2. Полученную суспензию центрифугируют для осаждения вирусных РНП.

Полипептидный состав осадка и супернатанта анализируют с помощью электрофореза. Как показал анализ, при суспендировании при рН более 4,5 матриксный белок М1 сохраняет связь с РНП и осаждается с ним через раствор 20 -ного глицерина и отсутствует в соответствующей фракции супернатанта. При суспендировании в буфере в диапазоне рН 3,0 — 4,5 белок

М1 избирательно диссоциирует с РНП и переходит во фракцию супернатанта и практически отсутствует в соответствующих фракциях осадка.

B результате анап1,за можно заключить, что изолированный предлагаемым способом белок М1 находится в растворимом состоянии преимущественно в форме мономеров. Аналогичные результаты по выделению белка М1 чри ислы рН погучены для всех исследованных штаммов вируса гриппа типов А. B

Способ меж т иметь ш рокое применение - медицине и p«разработке диагностикумов и вакуумных препаратов «в б«олог«« для Структурных и фs í l|èÎíапьнык исспе дований белков и сyásèpóñíûê структур.

Формула изобретения

Способ Bt,läå åí1Я матриксного белка

М1 ортомикссвирусов путем избирательной солюбилизац«и его из е«р«онов. î -, п и ч аю шийся тем, что. с целью получения нативного неагрег1 оованного белка М 1, солюбипизацию осущесвпяют путем депротеинизации вирионов воздействием 0.5—

1,0о неионного детергента Ni -40 ипи TN101 в нейтральной или слабощелочной среде с 2 — 20 мМ трис-,.ËÝÑ или трис-ГЭПЭС буфера (рН 6,8 — 8,0), с последующей обработкой 0,1 — 0,4 -ным неионным детергентом Г4Р-40 или TN-101 s кислой среде (рН 3,0 — 4,5) с 5 — 30 мМ цитратнсго или фосфоцитратного буфера и получением конечного продукта в результате очистки материала от вирусного РНП центрифуг«роеанием.