Способ определения @ -субъединицы фактора роста нервов

 

Изобретение относится к анализу биологических материалов и может быт, использовано для количественного определения А-субъединицы фактора роста нервов в биологическом натериале. Цель изобретения заключается в. полипении чувствительности определения р субъединицы Лактора роста нервов (А-ФРН). Сущность изобретения состоит в том,, что определение проводят радиоиммунологичееким способом, при этом животных иммунизируют комплексной.формой ФРН, очистку образовавшихся антител проводят на аффинном носителе с ковалентно .связанного А-ФРН при помощи элюцин раствором, содержщим 0,2 - 0,5 М NaCl, рИ °.,3. Радиоактивную метку 25 I п штитела вводят с помощью и о доге «(а в виде твердом Аази, на которую сорбируют намеченные антитела , используют полистирол. По сравнению с прототипом способ позволяет повысить чувствительность определения А-ФРН с,1 до 0,1 нг/мл. 1 табл.

ф

СОЮЗ СОЭЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G О! N 33/534

0flNCAHME ИЗСБРЕТЕЙЙЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

fO ИЭОБРАЖЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

OPH ГКНТ СССР (21) 4767963/14 ("2) 08. 12. 89 (46) 23.01. 92. Бюл, Р 3 (71) Институт физиологии AH БССР (72) Н.В.Горбунова и В.С.Лукашевич (53) 612.015 (088, 8) . (56) Heudrv Е., Addisac G. Res.Èåd.: . Neurucherur p., 1978, ч. 4, р. 286-306, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ р-СУБЪЕг111НИЦ!!

ФАКТОРА РОСТЛ НЕРВОВ (57) Изобретение относится к анализу биологических материалов и может быт . использовано для количественного определения jjj-субъединнцы фактора роста нервов в биологическом материале. Пель изобретения заключается B. попьгг«ении чувствительности определения Р-субьИзобретение относится к анализу биологических материалов и может быть использовано для количественного определения р-субъединипг.I фактора роста нервов (P-ФРН) и биологическом материале °

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ осуцестпляется следующим образом.

Иммуноген — коиплексную *орму ФРН получают из подчелюстньг. слюннь«х пелез полово"-релых беспородных самцов

1г.;.шей с использованием методов гель, ),л р 1«), ю °, ° е ) f ° юл °,.1g ii г т1 фии. Полученная комн:1екеная форма % Н представляет собой белок с молекулярной иассой 140 кД, состояг«нй нз двух

Ot g †-,, и одной -субъединицы, несу80„„17О754О А I

2 единицы *актора роста -нервов (-ФРН).

Суцность изобретения состоит в тои,. что определение проводят радиоиимунологическим способом, при этом животных имиунизируит коиплексной формой

ФРН, очистку образовавшихся антител проводят на афг гиннои носителе с ковалентно связанной -ФРН при помощи элюции раствором, содержавшим О,"

0,5 И NaC1, рП ", 3. Радиоактивную метку « з I и гнтитела вводят с поиоцью иодоге «а и виде твердой *азы, на которую сорбируют намеченные антитела, используют полистирол. По сравнению с прототипом способ позволяет повысить чувстзительность определения

1 -ФРН с,1 до 0,1 нг, ил. 1 табл.

Ф \

44

I Ю щей биологическую активность. Лнтите-. ла получают путем пролонгированной иммунизации новозеландских кроликов выделенной коиплексной формой ФРИ с добавлениеи полного адъюванта Фпейнда у ("Жйсо" С! !Л) 3 раза с двухнедельныи @ интервалом в дозе !"..5 икг!кг, затем через 60 — 40 дней по 60 икг!кг. Через ,5-3 месяца от начала иммунизации от.1 бирают у кроликов кровь длл получения антисыворотки.

Р-субъединицу ФРН для проведения афониной хроматографии пь«деллют ионо— обменной хроматограгэггей. Иииобг«лнзапггг г « полученной субъедгнпгцьг::ронодят на н г- снтеле СИВг-актипнропанной сефарозе

4В ("Pharnacia" Ипецил). Отиыпку г

СКВг-активнрованной сефарозы 4В проводят ..00 ил 1:. !! !!С1 на стекгтяннои

9 ;1- 3

1707540 фильтре. Через CNBr-активированную сефароэу 4В быстро (ЗО с) пропускают

30 мл охлажденного бикарбонатного буфера (раствор 0,2 М НаНСО, содержаг1ий5

0,2 I1 МаС1 рН 8,5); суспендируют ее с 5 иг tt-ФРН, находящегося в 15 мл этого же охлажденного буфера, и перемешивают с помоцью встряхивателя .("Prened" ПНР) в течение 2 ч. Избы- - 10 ток Р-ФРН удаляют центрифугированием с последуюцей промывкой бикарбонатным буфером, оставшиеся активные группы инактивируют обработкой 0,1 М трисНС1 рН 8,0 в течение 2 ч при встря- 15 хивании. Далее отмывают -

0,05 М трис-НС1 рН 8,0; 1 ?1 NaCI

0,4Х-ный холат натрия ("Serva" ФРГ) 20 (200 мл); 0,05 It трис-HCI рН 8,0;

0,2 М NaCI (200 мл); 0,5 М NaCI в

0,01 М НС1 рН 2,3 (200 мл)р 0,05 М трис-НС1 РН 8,0; 0,2 М NaCI (200 мл).

Инкубацию 5 ил антисиворотки к ком- 5 плексной форме ФРН с Р-ФРН-сефароэой

4В проводят в пробирке в течение 3 ч при комнатной температуре, перемешивая. Далее носитель отмыва:,: от неспецифически сорбированных белков до 30 тех пор, пока оптическая плотность (Дл п ) супернатанта не становится ниже 0,05. Содержимое пробирки переносят на стеклянньп фильтр и промывают следуюцими растворами:- 0,05 It .35 трис-НС1 рН 8,0; 1 М NaCI (500 мл);

D,05 И трис-HCI рН 8,0; 1 It NaCI, 0,4Х-ный холат натрия (300 мл);

0,05 М ацетатньпi буфер рН 5,0 (300 мл); 0,05 М трис-НС1 рН 7,5; 40

0,2 М NaCI (300 мл); бидистиллированная вода (200 мл). Суспензию помецают в це утрифужную пробирку и центрифугируют (3000 об/мин) на МРЧ-310 (ПНР) в течение 3 мин. 45

Элюцию молекул антител, адсорбированных на иммобилизованном лиганде проводят, используя раствор 0,01 М

НС1 рН 2,3, содержагщй О,"-0,5 It NaCI ° 50

К осадку добавляют 5 мл охлахренного раствора элюируюг его буфера. Содеряя-, мое пробирки встряхивают на холоде в течение 15- 0 мин. Су .пензию центрифугируют (30 н0 оо, мин, 3 мнн). Опе— рацию получения элюата повторяют дважды. Затеи концентрируют антитела к P-ФРН (AT P-ФРН), нейтрализуют 1 М

Na0H до рН 7,0 и лиофилизируют. и финный сорбент регенерируют 0,2 M

NaCl в 0,05 М трис-HCI буфере, рН 8,0.

Введение радиоактивной метки в аффинно очиг енные антитела осуцествляют следуюцим образом: 1 мг иодогена (1,3,4,6-тетрахлоро-ЗК,6(К-дифенил глуколурил) (Pierce" С1 1А) растворяют в 10 мл перегнанного хлороформа. Из полученного раствора отбирают аликвоту 1,6 мл, которую доводят до 10 мл перегнанным хлороформом и перемешивают. В пробирку для радиоиодирования вносят 4 мкг иодогена в 250 мкл и удаляют растворитель под небольшим тоКоМ инертного газа. Полученные пробирки хранят в морозильнике при -16 С м течение 2-3 месяцев.

В пробирку с 4 мкг иодогена последовательно вносят 50 мкл Na I в

0,2 М трис-HCI буфере рН 6,4 и 90 мкг

АТр,, доводят инкубационную смесь до 250 мкл вышеуказанным буферным раствором. Инкубируют при комнатной температуре 10 мин; Для отделения I-AT от продуктов радиоиоди-;--q pu роваиия реакционную смесь хроматографируют на колонке (0,9х60 см) с сефакрилом S-200 ("Pharnacia" г1веция) или To@perl Н1 -60 superfine ("Тоуозоda" Япония), уравновешенной в 0,05 It фосфатном буфере рН 7,4, содержашем

0,17-ньп1 бычий сывороточньпЧ альбумин.

Элюат собирают по 0,5-0,7 мл в пробирки содержацие 0,5 мл раствора 17,-ного бычьего сывороточного альбумина в О, 05 М фосфатном буфере р Н 7, 4 .

Удельная радиоактивность < .Т—

ATp p составляет 4-6 мкКи/мкг. ТХУосаждаемая радиоактивность в среднем находится в пределах 88-95Х.

В качестве сорбеита антител (афонино очиценньгх АТр „„ ) используют полистирол, например, в виде плангаета ("Р1ост" Великобритания).

Сме1пивание антител и антигенов при проведении иммунохимической реакции производят следующим образом. Покрывают лунки полистироловых пЛаншетов

2 мкг ЛТр <р п в 200 мкл 0,1 М трис-НС1 буфера рН 7,5 и инкубируют в термостате в течение 2 ч при 37 С; блокио руют остаточные белок-связывавшие участки полистирола (трижды прогпп ая лл1ки) 0,05 М фосфатным б; ерн1м р".còâoром рН 7,4, содержацим 11-ный бычий сывороточный альбумин, 0,!5 М МаС1

0,057. азид натрия ("Serva" ФРГ) (буфер для анализа); ннкубируют (17 ч, 5

1707540

При- Концентрация иер NaCl, И

Количество

Л7,1, Mrг/ил

500

0,1

0,2

0,5

Формула и зо брет ения

Составитель Л.Скурат

ТехРед tt.tlîðãåíòaë Корректор Л.Обручар

Редактор Н.Лазаренко

Заказ 264 Тнрал Подплсное

РЧИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул . Гагаонна, 101

4 С) со стандартныи)| растйораии -ФРЧ (0,1 †10 нг/мл) в 200 мкл буфера для анализа или с обраэцаии, тестируемыми на его Присутствие. 0тм)ь)ают лун-5 ки буЛером для анализа (три)ХцM) инкубируют 1 (-Лт „(100000 имп, мин на лунку) в 200 мкл буЛера для анализа в течение 4 ч при 57 С; отмывают о (трижды) буЛерои для анализа. Затем лунки вырезают, поиецают в пробирки для счета радиоактивности на гаммасчетчике ("Tracor Ar)alirtic" С!А) . Содержание -ФРН определяют по калибровочной кривой. 15

П р и и е р 1. 1Ьмунизацию живот- ных, введение радиоактивной метки (изотоп Т) в антитела, проведение имиуиохимической реакц||и и ее оценку осуцествляют аналогично описанному. 2О

При очистке AT) (ppg аЛЛинной хроматот раЬией злюцию проводят, используя раствор 0,1М НаС1 в 0,01 И НС1, рН 2,3.

П р и и е р ?. Иммунизацию живот- 25 ных, введение радиоактивной метки (изотоп " I) в антитела, проведение иммунохш|ичсской реакции и ее оценку осуцествляют согласно примеру 1. При очистке AHI) >p,< а|@инной хроиатографи- 3(ei элюцию проводят, используя раствор 0,2 И NaC1 и 0,01 И НС1, рН 2,3.

П р и и е р 3. Иммунизацию животных, введение радиоактивной метки (изотоп Т) в антитела, проведение

Ыб иммунохимической реакции и ее оценку осуществляют согласно примерам 1 и 2.

При очистке ЛТ алинкой хромато— .графией глюц||ю проводят, используя раствор 0,5 И NaC1 в 0,01 И НС1, 4р . рП ",3. Дальнейшее пов|г ение концентрации NaC1 при элюции ЛТ) „ „ не приводит к увеличению выхода.

Количество ЛТ), „, элюированных растворами, различа))с|нинся ионной си- 45 лой при рН ",3, приведены в таблице.

Как «идно нэ таблицы, злю||||я раствором 0,2 — 0,5 tf БаС1 при p)i ",3 обеспечивает увеличение количества получен|н|х ЛТа.gp), nn сравнению с элюцней растворои 0,1 М ИаС1 при рН ?,3 в 3,6 и 5,0 раэ соответственно.

flo сравнению с иэвестныи предлагаем|.|й способ позволяет повысить чувствительность определения Р-ФРН с 1нг/мл до 0,1 нг/мл.

Cnocoб определения p субъединицы фактора роста нервов,.вКлючаюг|ий иммунизацию животных иммуногеном, очистку антител, введение в них радиоактивной метки изотоп 1 I с помоцью окислителя, иимобилизацию неиече ых антител на твердую Лазу, проведение |ж",vI нохимической реакции путем смешивания антигена с иииобилиэованныш и иечеными антителаии, радиометрию и расчет содержания Р-субъедпницы Лактс ра роста нервов по калибровочной кривой, о т л и ч а ю г| и и с я теи, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве ии)|уногена KHBQT ныи вводят комплексную Лорму Лактора роста нервов, очистку антител проводят на а< .)Линнои носителе с коваленгно связанной P — субьединицей Ьактора роста нервов при поиоци элюции раствором, содержацим 0,2 — 0,5 И NaC1, рН ",3, в качестве окислителя при введении метки применяют иодоген, а п качестве твердой haçï используют полистирол,