Способ индикации токсинов сlоsтridiuм perfringens

 

Использование: ветеринарная микробиология , диагностика клостридиозов. Сущность изобретения: ставят реакцию коагглютинации со стафилококковым реагентом . В качестве антител берут иммуноглобулины овцы. Компоненты реакции в равных объемах в глицин-HCI буферном растворе. Повышается чувствительность способа, упрощается изготовление реагента . 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБ.1ИК (5!)5 С 12 0 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4814144/13 (22) 16.04.90 (46) 07,07.92. Бюл. Я 25 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт (72) В.И. Виноградова, О;Н; Смирнова, ОА Котылев и Ю.В. Студенцов (53),576.8.097.29(088.8) (56) Методические рекомендации по экспрессному способу выявления бактериальных токсинов и анатоксинов в реакции коагглютинации с помощью специфически направленного стафилококкового реагента.

Пермь. Пермский институт вакцин и сывороток; 1987.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к выявлению в первичных посевах исследуемого материала токсигенных штаммов возбудителя инфекционной энтеротоксемии, может быть рекомендовано производственным ветеринарным лабораториям для ускоренного обнаружения токсина Cl. perfringens.

Известен способ индикации токсинов с помощью реакции коагглютинации (PKOA) специфически направленного стафилококкового реагента (антительного диагностикума) и антигена исследуемого материала.

Недостатком известного способа является необходимость использования для изготовления специфически направленного стафилококкового реагента антител кроличьей антитоксической сыворотки О.

perfrtngens. изготовление и контроль которой требуют дополнительного времени, повышают стоимость конечного продукта (антительного диагностикума). Чувствитель„„ Ы,, 1745768 А1 (54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ТОКСИНОВ

CL0STRtDIUM PERFRINGENS (57) Использование: ветеринарная микробиология, диагностика клостридиозов. Сущность изобретения: ставят реакцию коагглютинации со стафилококковым реагентом. В качестве антител берут иммуноглобулины овцы, Компоненты реакции в равных объемах в глицин-.HCI буферном растворе. Повышается чувствительность способа, упрощается изготовление реагента. 3 табл.. ность реакции коагглютинации по известномуспособу не превышает 0,02 единицы связывания антигена;

Целью изобретения является повышение чувствительности и экономичности способа выявления токсинов CI. perfrlngens npu сохранении его специфичности. ф . Цель достигается процессом изготовле- ц1 ния специфически направленного стафилококкового реагента (антител ьного диагностикума) и новой технологией постановки реакции коагглютинации.

Сущность изобретения заключается в том, что в реакции коагглютинации в качестве специфически направленного стафило- ь коккового реагента применяют взвесь стафилококков, сенсибилизированных антителами овечьей иммунной стандартной сы воротки, а реакцию ставят в среде раствора глицин-НС! буфера, каждый из реагентов вносят при постановке реакции в равных объемных количествах.

1745768

Способ осуществляют следующим образом.

Чистые антитела Cl. perfrlngens иэ соответствующих иммунных овечьих сывороток извлекают с помощью иммуньсорбции, Сыворотки диагностические антитоксические

О. perfrlngens типов А, С, О, Е. предназначенные для диагностики заболеваний животных, вызываемых микробами CI.

perfrlngens. В качестве иммуносорбента используют цианбромированную агарозу 4В, на которой иммобилизован токсин Cl.

perfrlngens. Чистые антитела, злюированные с иммуносорбента, фиксируют на 107,ной взвеси стафилококка (штамм CO AH-ТУ

42.14) путем его сенсибилизации. Сенсибилизированный чистыми антителами стафилококк представляет собой специфически направленный стафилококковый реагент—

СНСР— антительный диагностикум.:

Стафилококковый реагент, содержащий белок А, сухой, выпускается по ТУ 42.14. для серологических исследований. Время изготовления диагностикума составляет 7 ч.

Специфически направленный стафи.лококковый реагент, изготовленный описанным путем, обладает высокой чувствительностью и специфичнсйтью при использовании его в реакции агглютинации, проводимой по предлагаемой технологии.

Предлагаемая технология постановки реакции коагглютинации при выявлении токсина С . р rfrlngens в исследуемом материале заключается в следующем, На пред, метное стекло наносят 0,05 мл (1 каплю) исследуемого материала (например, копрофильтрата), затем добавляют 0.05 мл (1 каплю) СНСР и 0,05 мл глицин-НО буферного растворе. Плавным покачиванием предметного стекла капли перемешивают. Реакцию учитывают в течение от 30 с до 3 мин. При наличии токсинов О. perfrlngens в исследуемом материале на стекле наблюдается четкая агглютинация с полным просветлением капли. Реакцию оценивают по общепринятой четырехкрестовой шкале:

++++ — полная коагглютинация, полное просветление смеси — резко положительная;

+++ — хорошо выраженная коагглютинация, явное просветление смеси — положительная;

++ — неполная коагглютинация с заметным просветлением смеси — слабо положительная; — — отсутствие коагглютинации — отрицательная.

Заключение о принадлежности исследуемого антигена — токсина Cl, perfrlngens делают на основании положительной реак55

50 ции коагглютинации не менее, чем на +++, при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле, Предлагаемый способ индикации токсинов Cl. perfrlngens позволяет выявлять

0,0007 летальной мышиной дозы (ДЛМ) этого токсина.

Пример 1. Чувствительность реакции коагглютинации по предлагаемому способу контролируют на последовательном ряде разведений глицеринизированных токсинов Cl. perfringens.

Полученные данные приведены в табл. 1.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявлять токсин в количестве

0,0007 ДЛМ, т, е. чувствительность его значительно выше чувствительности известного способа.

Пример 2. Выявление токсинов О.

perfrlngens в шестичасовых культурах-продуцентах токсинов Cl.perfrlngens типов В.

С, О. Данные приведены в табл. 2.

Таким образом, при оценке токсигенных культур чувствительность предлагаемого способа значительно превышает чувствительность известного.

Пример 3. Специфичность нового антительного диагностикума, изготовленного по описанной технологии, контролируют в реакции коагглютинации по предлагаемому и известному способам с культурами Е.Coll u анатоксинами О. Botyllnum (типы В и Е).

Полученные данные приведены в табл. 3, Квк видно из приведенных в табл. 3 данных, антительный диагностикум, изготовленный по предлагаемой технологии, не вступает в реакцию агглютинации с гетерогенными антигенами {культура К. Coll и анатоксин Cl. Botyllnum) при положительной реакции с антигенами О. perfrlngens, т. е. является специфическим.

Использование предлагаемого способа выявления токсинов О. perfingens в биологическом материале позволяет (по сравнению с существующим) резко снизить затраты на изготовление специфически направленного стафилококкового реагента (антительного диагностикума), так как отпадает необходимость получения и контроля соответствующих кроличьих гипериммунных сывороток и делает возможным использование для сенсибилизации стафилококка стандартных овечьих иммунных сывороток, выпускаемых биологической промышленностью.

Повышение чувствительности реакции коагглютинации при сохранении ее специфичности делает возможным выявление минимального количества токсинов Cl.

1745768

Таблица 1

Таблица 2

perfrl igens в исследуемом биологическом материале, не выявляемых с помощью известного способа.

Формула изобретения

Способ индикации . токсинов

Clostrldlum perfrlngens путем постановки реакции коагглютинации исследуемых токсинов со стафилококковым реагентом, сенсибилизированным специфическими антителами, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, в качестве специфических антител

5 используют иммуноглобулины овцы, а реакцию ставят в глицин-НО буферном растворе (pH 2,3-2,4), при этор компоненты реакции берут в равных обьемах.

1745768

8 э

Таблица 3

Составитель В, Калмыков

Техред М.Моргентал Корректор О. Ципле

Редактор Н. Гунько

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101

Заказ 2365 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5