Способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину

 

Изобретение относится к медицине конкретно к способу определения чувстви тельности вируса гриппа к ремантадину Цель изобретения - ускорение анализа и упрощение способа В двухкамерную электрохимическую ячейку, разделенную бислойной липидной мембраной добавляют в одну камеру раствор белка исследуемого вируса гриппа, измеряют потенциал и при увеличении потенциала после добавления реманта дина вирус считают чувствительным к действию ремантадина. По сравнению с прототипом происходит сокращение времени анализа с н ескольких часов до 2-3 мин и упрощается cnocoja за счет использования электрохимической ячейки

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (54)5 6 01 N 33/15

У1709Щ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4703425/14 (22) 14,06.89 (46) 30.07 .92.Бюл. N. 28 (71) Институт электрохимии им. А.H,Ôðóìкина (72) В.В.Черный, С.Г,Тулькес. M.Â.Ñèìîíîва, Г.К.Воркунова, В.Ю.Ковтун, В.С.Соколов

В. С, Маркин (56) Ворхунова Г.К., Тулькес С,Г., Букринская А,Г, Молекулярная генетика, микробиология, вирусология, 1983, N 2, с. 43-47. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВИРУСА ГРИППА К РЕМАНТАДИНУ

Изобретение относится к медицине; конкретно к способу определенИя чувствительности вируса гриппа к ремантадину, Различные варианты вируса гриппа обладают разной чувствительностью к химиотерапевтическим препаратам. Вирус гриппа

В устойчив к амантадину и проявляет слабую чувствительность к ремантадину. Вирус гриппа А характеризуется выраженной чувствительностью к этим препаратам, поэтому они широко используются в профилактике и лечении гриппа. Однако не исключено появление вариантов вируса гриппа А нечувствительных к ремантадийу.

Поэтому в период массовых заболеваний гриппом целесообразно определять чувствительность конкретного варианта вируса гриппа, вызвавшего эпидемию,к ремантадину с целью рекомендации использования или не использования препарата в профилактике и терапии заболевания.. Ю 1751б68 А1 (57) Изобретение относится к медицине, конкретно к способу определения чувствительности вируса гриппа к. ремантадину.

Цель изобретения — ускорение анализа и упрощение способа, В двухкамерную электрохимическую ячейку, разделенную бислойной липидной мембраной добавляют в одну камеру раствор белка исследуемого вируса гриппа, измеряют потенциал и при увеличении потенциала после добавления ремантадина вирус считают чувствительным к действию ремантадина, По сравнению с прототипом происходит сокращение времени аналйза с нескольких часов до 2-3 мин и упрощается способ за счет использования электрохимической ячейки.

Известно определение чувствительности вариантов вируса гриппа к ремантадину по ассоциации меченного матриксного белка (М-белка) вируса с липосомами в присутствии ремантадина, Недостатком известного способа является необходимость получения липосом, соуержащих меченые С M-белки, меченого

Н ремантадина, сложность и многоступенчатость процессов измерения .

Наиболее близким предлагаемому способу является способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину с применением метода электрофореза. Инкубированный с ремантадином вирусный белок чувствительного к ремантадину и резистентного вариантов вируса гриппа, после предварительных процедур и подготовки к электрофорезу наносят íà 10%-ный

ПААГ. После проведения фореза окрашивали гель амидочерным, нарезали на полоски

1751668 и растворяли в 30%-ном растворе перекиси водорода. Затем измерили радиоактивность проб, нанесенйых на бумажные мишени. Наличие метки Н, обусловленной меченным тритием ремантадином, в про- 5 бах, отвечающих локализации M-белка, свидетельствует о связывании M-белка ремайтадина.,Налйчие такого рода ассоциаций характерно в случае чувствительного к ремантадину варианта вируса. 10

К недостаткам данного метода следует отнести необходимость получения ремантадина, меченого тритием (что требует отработки специальной технологии в соответствующих условиях), необходимость 15 проведения многочисленных операций по удалению не связавшегося Н-ремантаз дина, трудоемкрстью процессов приготовления и последующей после фореза обработки геля, а также затратами времени 20 на электрофореэ.

Цель изобретения — ускорение анализа и упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом. 25

В один из отсеков измерительной ячейки установки для излучения электрических свойств бислойной липидной мембраны

: (БЛМ) вносят при НОстоянйом-йеремешивании вирусный М-белок. При этом регистри- 30 руют значение разности граничных потенциалов БЛМ, сформированной на отверстии тефлоновой перегородки, разделяющей отсеки, заполненные солевым раствором. Полученное значение принима- 35 ется за начальную точку отсчета. После этого в тот же отсек добавляют ремантадин (при перемешивании) и регистрируют изменение граничного потенциала мембраны

Ьу. Результаты сравнивают со значением 40

Лф,"йблученнйм в аналогичных условиях при добавлении в ячейку той же концентрации ремантадина, но в отсутствие M-белка. "

Если измеренные таким образом скачки потенциала близки или совпадают, это гово- 45 рит о том, что вирус, из которого выделен

М-белок, устойчив к ремантадину. Превышение полученных значений Ар над контрольнымй свидетельствует о чувствительности вируса к ремантадину, 50

От прототипа способ отличается тем, что взаимодействие (связывание) М-белка вируса гриппа с ремантадином определяют по изменению разности граничных потенциалов БЛМ, которое наблюдается при ве- 55 дении по одну иэ ее сторон в солевой раствор M-бЕлка и ремантадина.

Пример 1. Бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировали по методу

Мюллер; -Рудина в тефлоновой ячейке с двумя отсеками на отверстии диаметром 0,8-1 мм иэ деканового раствора (50 мг/мл) -Qфосфатидилколина фирмы "Sigma". Водные растворы содержали 5мМКС1 и 5ММКНуРО< (ма рки ХЧ), рН 7,4.

Вирусные M-белки выделяли из чувствительного и устойчивого к ремантадину штаммов вируса гриппа. Контроль чистоты и нативности M-белка осуществляли посредством электрофореза (пластинчатого) в

10%-ном ПААГ (полиакриламидный гель) в присутствии додецилсульфата натрия в те-чении 18 — 20 ч при силе тока 6 — 8 мА. M-белок не содержал примеси других белков, не менял своей электрофоретической подвижности, располагаясь в той же зоне, в которой обычно распределяется М-белок вируса.

Измерения граничных потенциалов на

БЛМ проводили методом компенсации внутримембранного поля (КВП) с использованием второй гармоники емкостного тока.

С помощью этого метода регистрировали разность граничных потенциалов (hp) с обеих сторон мембраны, В один из отсеков измерительной ячейки вносили при стабильном перемешивании вирусный М-белок (5 мкг/мл). При этом регистрировали значение разности граничных потенциалов БЛМ, сформированной на отверстии тефлоновой перегородки, разделяющей отсеки, заполненные солевым раствором. Полученное значение принимали за начальную точку отсчета. После этого в тот же отсек добавляется ремантадин (при перемешивании) и регистрируют изменеwe граничного потеницала мембраны Лр

Результаты сравнивают со значением Лр, полученным в аналогичных условиях при добавлении в ячейку той же концентрации ремантадина, но в отсутствии M-белка (контроль). Если измеренные таким образом скачки потенциала близки или совпадают, то вирус, из которого выделен M-белок, устойчив к ремантадину. Превышение полученных значений Лр над контрольными свидетельствует о чувствительности вируса к ремантадину. Для оценки чувствительности к ремантадину каждого данного варианта вируса гриппа достаточно внести по одну из сторон БЛМ в солевой раствор 5 мгlмл

M-белка и 1 мМ рементадина. О чувствительности вируса к ремантадину будет свидетельствовать превышение более чем на

10 мВ значений скачков потенциалов в присутствии M-белка над контрольными.

Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами: позволяет существенно упростить процесс.

1751668

Составитель В,Литовченко

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Филь

Редактор А.Долинич

Заказ 2688 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 так как отпадает необходимость в нечетных радиоактивностью С M-белке и Н реман4 з тадине, а следовательно, в необходимости специального оборудования условий для работ с радиоактивностью, Отпадает необходимость в проведении многочасового злектрофореза, Весь процесс измерения при наличии контрольной кривой занимает несколько минут. (Формула изобретения

Способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину путем выделения белка-М ич вируса гриппа и инкубации белка-М в присутствии ремантадина, о т л ич à ю шийся тем, что, с целью сокращения времени и упрощения способа, измеряют

5 граничные потенциалы бислойной липидной мембраны после ее инкубации с белкомM и после инкубации в присутствии ремантадина и при увеличении потенциала мембраны более чем на 10 мВ в сравнении

10 с потенциалом после инкубации ее с ремантадином, определяют чувствительность виру: са гриппа к действию ремантадина.