Способ культивирования лежалой пыльцы табака niсотiаnа тавасuм l
Использование: биотехнология и биохимия растений. Сущность изобретения: пыльцу табака, хранившуюся в течение длительного времени, культивируют на стандартной питательной среде, в которую в качестве стимулятора дополнительно вводят 1,4-бис- 1-{2-этоксиэтил}-4-оксипиперидил-4 1 3-бутадиин (БИЭТОБ) в концентрации 25-100 мкг на 1 мл среды 2 табл.
СОЮЗ СОВЕ ГСКИХ сОцидлистических
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ
Г10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1) 4882178/13 (22) 12,11.90. (46) 15,07.92. Бюл. М 26 (71) Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина (72) З.Г.Айташева, В.К.Ю, М.К.Карабаев и
К.Д.Пралиев (53) 57.086.83(088 .8) (56) Голубинский И.Н. Искусственные среды для прорэщивания пыльцы. В кн.: Биология прорастания пыльцы. — Наукова думка, 1974. с. 62 — 74, Brewbaker1,1., Kwack B,Н. The essential.
role of calcium iori in pollen germination and
pollen tube growth. American Journal of
Botany, 50. 859 — 865, 1963.
Capkova V., Hrabetova Е., Tupy J. Protein
changes in tobacco pollen culture; à newly
synthesized protein related to pollen tube
growth. Plant Physiology, 130, 307-314, 1987.
Изобретение относится к биотехнологии и биохимии растений и может быть применено для модельных экспериментов в области молекулярной биологии эмбриогенеза.
Известны способы проращивания свежей пыльцы высших растений на искусственных средах. Наряду с использованием чистых растворов сахарозы, указывается на возможность добавления в среду физиоло-. гически активных веществ, стимулирующий эффект воздействия которых стабилизируется борной кислотой. Так, npvi введении в средудля проращивэния свежей пыльцы та-. бака крылатого (Nicotiana alata Link. et
Otto)2,4-D в концентрации 10 -10 % эффективность прорастания достигала в средм Ж 1746954А1
TABACUM L (57) Использование: биотехнология и биохимия растений. Сущность изобретения: пыльцу табака, хранившуюся в течение длительного времени, культивируют на стандартной питательной среде, в которую в качестве стимулятора дополнительно вводя т 1,4-бис-(1 (2-этоксиэтил)-4-оксипиперидип-4)1,3-бутадиин (БИЭТОБ) в концентрации 25-100 мкг на 1 мл среды. 2 табл. нем 27,3 и превышала контроль почти в 2.5 раза. Однако конкретные способы прорэщивания лежалой пыльцы не описаны. Известен способ культивирования свежей пыльцы табака Nicotiana Tabacum L., выбранный в качестве прототипа, в котором пыльца проращивается на искусственной питательной среде. содержащей 25 мМ MES-KOH, рН 5,9, 180-300 мМ сахарозы, 1,6 мМ НЗВОз, 3 мМ Са(КОЗ)2, 0.8 мМ М9$0а 1 мМ КМОз Добавление гидропизата казеина (+1 мл на 1 мл среды) позволяет продлить культивирование трубок до 48 ч. Однако данные по проращиванию лежалой пыльцы отсутствуют. Между тем, при отсутствии благоприятных полевых условий и нехватки 1746954 холодильного оборудования необходимо использовать старый материал. Цель изобретения — повышение эффективности прорастания лежалой пыльцы табака Nicotiana tabacum L. Указанная цель достигается тем, что в известном способе культивирования пыльцы табака Nicotiana tabacum L на стандартной питательной среде с введением добавки, в качестве последней используют 1,4-бис-(1-(2-этокси-этил)-4-оксипиперидил -4)-1,3-бутадиин (БИЭТОБ) в концентрациях 25-100 мкг на 1 мл среды. БИЭТОБ — новое химическое соединение (N. гос. регистрации 8530488), обладающее противоаритми-, ческой активностью. В предлагаемом способе используется пыльца. хранившаяся в течение 12 мес.и более. Пример 1. Перед употреблением БИЭТОБ растворяют в бидистиллированной воде в концентрации 5 мг/мл, стерилизуюг холодным способом через мембранный фильтр "Millipore" (размер пор 0,22 мкм). Маточный раствор БИЭТОБа хранят в пробирке s замороженном виде (-18" С) и используют многократно. Стандартную питательную среду без сахарозы готовят в виде 5-кратного исходного раствора и добавляют перед употреблением сахарозу из исходного 30%-ного водного раствора. Оба исходных раствора также хранят на холоде и используют многократно, 5 мг пыльцы N. tabacum (сорта Samsun). хранившийся в течение 12 мес и более при о -20 С, культивируют в асептических условиЮ ях при 26 С в течение 18 ч в 10 мл стандартной питательной среды. содержащей 25 MM MES-KOH. pH 5,9, 180 мМ сахарозы, 1,6 MM НЗВО, 3 мМ Са(МОЭ) 0,8 мМ М9$04, 1 мМ KNOs с добавлением 1,4-бис-(1-(2-эгоксиэтил)-4-оксип иперидил-4)-1,3-бутадиина (БИЭТОБ) в концентрациях 25, 50. 100 мкг на 1 мл среды. Данные сведены в табл. 1. По окончании культивирования пыльцевые трубки собирают с помощью фильтрования, промывают водным раствором 10%-ной сахароэы и взвешивают на микроаналитических весах Sartorius MP 2004. Как следует иэ табл; 1, добавление.БИЭТОБа увеличивает выход биомассы трубок из лежалой пыльцы в среднем на полпорядка — порядок. при этом значение 50 мкгlмл является оптимальной концентрацией. Пример 2. Пыльцу культивируют, как описано в примере 1. По окончании инкуба15 20 смесь состоит из 50 мМ HERES-КОН, рН 7,8, 1 мкМ АТФ, цитоплазматических белков, 20 мкг и 32 Р-АТФ, из расчета 2 — 5х l0 импlмин на 100 мкл смеси, Реакцию проводят при 25 28-30 С в течение 30 мин на термостатируемой водяной бане. По окончании инкубации белки осаждают 70% этанола при -20 C в течение ночи и подвергают электрофорезу в ДСН-ПААГ с последующей радиоавтогра30 55 ции трубки фиксировали 4% формальдегида и производят подсчет их числа визуально с помощью гликроскопа (объектив 10x/0.32, цена деления 10 мкм) и фотографируют на черно-белую фотопленку Микрат-200. Из данных табл. 2 видно, что эффективность прорастания лежалой пыльцы в присутствии. БИЭТОБа возрастает более чем в 5 раз, что полностью согласуется с данными приглера 1, Пример 3. Прораставшую, как описано в предыдущих примерах, пыльцу без фиксации формальдегидом гомогенизировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCI. рН 7 6, 25 мМ КС(, 5 мМ М9Ог, 3 MM 2-МЭТ. 250 MM сахарозы (или 10% глицерина), центрифугируют при 16 000 об/мин в течение 20 мин. Цитоплазматические белки постмитохондриального супернатанта подвергают фосфорилированию in vitro. Реакционная фией. Фосфорилирование 70 кД полипептида имеет место и при наличии БИЭТОБа, и без его добавления в питательную среду для культивирования пыльцы. Сохранение данной посттрансляционной модификации несмо1ря на новые условия культивирования с дополнительным инградиентом (БИЭТОБ), служит веским основанием в пользу биохимической полноценности полученных пыльцевых трубок и его тождественности пыльцевому материалу, культивируемому в известных условиях. Формула изобретения Способ культивирования лежалой пыльцы табака Nicotiana tabacum 1... включающий помещение пыльцы на искусственную питательную среду со стимулятором роста. отличающийся тем. что, с целью повышения эффективности прорастания, в качестве стимулятора используют 1,4-бис(1-(2-этоксиэтил)-4-оксипиперидил-4)-1,3-б— утадиин в концентрации 25-100 мкг на 1 мл среды. 1746954 Таблица1 Зависимость биомассы пыльцы, прораставшей 18- на искусственной среде, от концентрации БИЭТОБа Таблица2 Эффективность прорастания трубок из лежалой пыльцы при добавлении БИЭТОБа Составитель 3.Айташева Редактор М.Кобылянская Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М.Демчик Заказ 2.Иг Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина. 101
