Способ определения малонового диальдегида в крови

 

Использование: медицина, способы определения в биологических системах малонового дйальдегида (МДА). Цель изобретения - повышение информативности способа за счет возможности одновременного анализа интенсивности процессов перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитов, а также характеристики состояния антиоксидантной активности. Сущность изобретения: определяют МДА раздельно в двух образцах одного объекта, причем в ОДНО.М из них - после инкубации образца с ингибитором свободнорадиальных реакций, например, ЭДТА-МДА-1, а в другом при активации перекисного окисления , например, ионами двухвалентного железа - МДА-2, -рассчитывают МДА-3, как (МДА-2)-(МДА-1) эндогенного активатора перекисного окисления липидов МДА- 1/МДА-3 и интегрального индекса интенсивности перекисного окисления липидов, представляющего собой (МДА-1) (МДА-3) (МДА-1/МДА-3), по которому судят либо о возрастании, либо об уменьшении перекисного окисления липидов в биологической системе . 1 табл, (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/52

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ, СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4823410/14 (22) 07.05.90 (46) 07,04.93. Бюл, ¹ t3 (71) Нижегородский научйо-исследовательский институт травматологии и ортопедии (72) В.Г.Сидоркин и И.А.Чулошникова (56) Л,И.Андреева и др, — Лабораторное дело, 1988, ¹ 11, с. 41 — 43. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА В КРОВИ (57) Использование:медицина, способы определения в биологических системах малонового диальдегида (МДА). Цель изобретения — повышение информативности способа за счет возможности одновременного анализа интенсивности процессов перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитов, а также характеристики состоИзобретение относится к технике определения в биологических системах малонового диальдегида (МДА) для характеристики происходящих в них процессов перекисного окисления липидов, что может быть использовано в различных областях экспериментальной и клинической медицины, а также биологии.

Целью изобретения является устранение существующих недостатков — повышение информационной значимости способа за счет возможности одновременного и раздельного анализа МДА в плазме и эритроцитах, а также определения в них антиоксидантной активности, что в конечном итоге позволит более адекватно оценивать состояние процессов ПОЛ в исследуемых биологических системах, „„. Ы„„1807410 А1 яния антиоксидантной активности. Сущность изобретения; определяют МДА раздельно в двух образцах одного объекта, причем в одном из них — после инкубации образца с ингибитором свободнорадиальных реакций, например, ЭДТА-МДА-1, а в другом при активации перекисного окисления, например, ионами двухвалентного железа — МДА-2,.рассчитывают МДА-З, как (МДА-2) — (МДА-1) эндоген ного активатора перекисного окисления липидов МДА1/МДА-3 и интегрального индекса интенсивности перекисного окисления липидов, представляющего собой (МДА-1) (МДА-3) (МДА-1/МДА-3), по которому судят либо о возрастании, либо об уменьшении перекисного окисления липидов в биологической системе, 1 табл, ЪФ

С)

Поставленная цель достигается за счет того, что содержание МДА определяют в е двух параллельных образцах, получаемых, из одного объекта. При этом процесс подго- Q товки к исследованию одного из параллельных образцов осуществляют в присутствии ингибитора свободнорадикальных реакций (антиоксиданта) — этилендиаминтетрауксус-, ной кислоты (ЭДТА), являющейся комплексоном и связывающей ионы железа, всегда присутствующих B ничтожных количествах в биологических системах и индуцирующих

ПОЛ. Кроме того, этот реагент является антикоагулянтом и предотвращает ее свертывание. Конечная концентрация ЭДТА в образце составляет 0,5-1,5 70. Более низкие концентрации реагента могут оказаться недостаточными для полного связывания эндогенных ионов двухвалентного железа, 1807410 инциирующих ПОЛ, а использование более антиоксидантные возможности. Таким обвысоких концентраций препарата является разом, антиоксидантная активность биолоизбыточным и не ведет к улучшению резуль- гической системы оценивается по величине татов. образовавшегося МДА-3 при индукции ПОЛ

Другой параллельный образец готовят в 5 стандартным зкзогенным активатором своотсутствии антиоксиданта и перед выполне- боднорадикальных реакций, Увеличение нием реакции МДА с ТБК проводят инкуба- МДА-3 в сравниваемой однотипной биолоцию образца с активатором гической системе следует расценить как свободнорадикальных реакций (проокси- снижение антиоксидатных свойств этой сидантом) — стандартным количеотвом ионов 10 стемы, что является фактором, способствудвухвалентного железа (конечная конЦент- ющим возрастанию свободнорадикальных рация реэгентз — 0,06 %). Время инкубации процессов. Уменьшение МДА-3 в этих услоподбирают экспериментальным путем, что- виях будет свидетельствовать о возрастабы оно было достаточным для прохождения, нии антиоксидантной емкости реакциииндукцииПОЛ;Приработесобраз- 15 биологической системы, что препятствует цэми крови наиболее подходящим време- распространению ПОЛ, Так как зависинем инкубации является 30 — 45 мин. Оба масть между выявленным количеством параллельных обрчазцз в каждом очередном - МДА-3 и антиоксидантной активностью сиисследовании всегда инкубируют в одних и ... стемы является обратной, то показатель антехжеусловияхвтечеийевыбранногостан-:20 тиоксидатной активности целесообразно дартного времени.. "... :-. выражать в условных единицах — как велиПо окончании.инкубации параллвльгные . чину концентрации МДА-3 с отрицательным образцы готовят для выполнения реакциис знаком, что удобно при графическом изоТБК и определяют в каждом из них конличе- бражении динаМики этого параметра. ство МДА. МДА, выявленный в параллелЬ- 25 При определении МДА в крови (разном образце, содержащем ингибитор дельно в плазме и эритроцитах) способ высвободнорадикальных реакций (ЭДТА), полняется следующим образом. обозначают как МДА-I, а содержащем про- Кровь на исследование забирают в 2 оксидант (ионы двухвалентного железа) — . пробирки;1-япробиркасодержит0,1млфикзк МДА-2; Разнйцу между МДАф и МДА-1 30 зиологического раствора в 10 ед гепарина в . обозначают как МДА-3. -: -: .:." - качестве знтикоагулянта; 2-я пробирка — 0,1

МДА-1 — пул МДА, образованный в бйо-.. мл 5 ф ЭДТА на физиологическом растворе, .логической системе в жйзом организме на В обе пробирки помещают по 1,0 мл крови момент получения образца (забора крови); (i îò÷çñ после ее получения), смесь тщательвследствие протекающей в ней процессов 35 "но перемешивают, не допуская образоваперекисногоокислениялипидов. Целесооб-; Нйя сгустков. На âñåõ этапах подготовки разно считать, что пул МДА-1 характеризует образцов не допускается попадание следо интенсивность процессов ПОЛ вданной би- вых количеств ЭДТА в пробирку с кровью, ологической сйстеме, В связи с этим возра- содержащей гейарин, стание МДА-1 расценивается как активация 40 Кровь центрифугируют 10 мин при 3000

ПОЛ, а снижение данного показателя — как об/мин; плазму отделяют от эритроцитов, уменьшение процесса лйпопербксидации. эритроцитарную массу однократно промыМДА-2 — сумма пулов МДА-1 и МДА-3 йают s 5мл физиологического раствора и (см, ниже). является промежуточным пока- центрифугируют.10 мин при 2000 об/мин. зателем и используется для расчета МДА-3; 45 Посгле осаждения эритроцитав физиологиМДА-3- пул МДА, образованный.в био- ческий раствор удаляют с 10-15 % поверхлогической системе при индукции ПОЛ ноСтно расположенных эритроцитов, стандартным экзогениым активатором сво- Отмытые эритроциты гемолизируют дистилбоднорадикальных реакций. Характеризует, . лированной водой в отношении 1: 5 (0,2 мл состояйие энтиоксидантной системы (анти- 5ц седимента эритроцитов + 1,0 мл дистиллиоксидантную емкость) и ее способность ровзнной воды). ИНаКтИВИрОВатЬ ПОЛ, ЕСЛИ рЯД рЭЗЛИЧНЫХ ДЛяИССЛЕдОВаНИя МДА-1 ГОтОвятсбраэобразЦов подвергнуть воздействию стан- .. Цы плазмы и эритроцитов, которые были в дэртного Экзоггейного активатора пзрекис- контактег с ЭДТА: 1-ю пробирку помещают ного окисления липидов, то минимальное 55 0к4йл плазмы, з во 2-ю — 0,4 мл гемолизата количество МДА образуется в том образце, эритроцитов. В каждую пробирку добавлякоторый располагает наиболее мощной ан- . ют0,1 мл5 j ЭДТА(конечная концентрация тиоксидантной системой, Напротив, макси- — Щ), Образцы перемешивают и оставляют мальйое количество МДА-3 будет в на30минпри37 С(илитермостатирование биологической системе, имеющей низкие

1807410

20

30

6. оп Е .80 13

1,58 10 0 4 где А — содержание МРА в мкмоль/л) или нмоль/мл) в плазме; 10 — коэффициент для пересчета концентрации исследуемого вещества в мкмоль/л; 5 — конечный объем реакционной смеси (мл); 0,4 — объем плазмы, взятый на анализ (мл); 1,56 10 — коэффициент молярной экстинкции ТБК-комплекса (моль см л); Eon — оптическая плотность исследуемого раствора по показанию спектрофотометра; 80,13 — пересчетный коэффициент.

55 проводят при постоянном легком покачивании проб).

Для исследования МДА-2 используют плазму и эритроциты образца крови, в котором в качестве антикоагулята был использо- 5 вэн гепарин: в 1-ю пробирку помещают 0,4 мл плазмы, а во 2-ю — 0,4 мл гемолизата эритроцитов; в обе пробирки добавляют по

0,1 мл свежеприготовленного 0,28 -ного водного раствора сернокислого железа (конечная концентрация -0,06 ). Смесь перемешивают и термостатируют в течение 30 мин, как описано выше.

По истечении времени инкубации во все пробирки добавляют по 2,5 мл дистиллиро ванной воды и 1,0 мл 20 трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Образцы тщательно перемешивают, К образцам, содержащим ЭДТА и сернокислое железо, готовят контроли, против: которых необходимо колориметрировать соответствующие пробы. Контроль, к образцам крови с ЭДТА: 0,1 мл 5 ЭДТА+ 2,9 мл дистиллированной воды+ 1,0 мл 20 ТХУ+, 0,1 мл 0,6 ТБК, Контроль к образцам крови без ЭДТА: 0,1 мл 0,28 g водного раствора сернокислого железа + 2,9 мл дистиллированной воды+1,0 мл ТХУ+ 1,0 мл 0,6 ТБК

Все образцы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. В высокие цилиндрические пробирки помещают по 1,0 мл 0,6 свежеприготовленной ТБК на дистиллированной воде и приливают надосадочную жидкость после центрифугирования образцов. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 30 мин, socle чего быстро охлаждают и производят спектрофотометрического исследование при длине волны 535 нм; при этом используют соответствующий контрольный раствор, против которого колориметрируют образец.

Расчет количества МДА в образцах плазмы крови производят по формуле:

Количество МДА в растворах эритроцитов рассчитывают аналогично за тем исключением, что в знаменателе объем седимента эритроцитов составляет 0,066 мл (с учетом разведения седимента эритроцитов водой 1

: 5 и использовали для анализа 0,4 мл гемолизатэ эритроцитов):

А = Еоп 480,80, где А — содержание МДА в мкмоль/л (или нмоль/мл) седимента эритроцитов, приготовленного при стандартных условиях осаждения клеток.

МДА-3 определяют как разность МДА-2 и МДА-1 (для плазмы и эритроцитов соответственно.

Пример . В плазме и эритроцитах белых крыс исследована интенсивность процессов ПОЛ и состояние антиоксидатной активности этих систем в динамике течения ожоговой болезни (см. табл.).

Показано, что интенсивность ПОЛ в плазме крови животных, выявленная по результатам анализа МДА-1, имеет сильную положительную корреляцию с динамикой этого процесса, определенного другим (известным) способом у этих же животных — путем исследования концентрации диеновых конъюгатов методом спектрофотометрии при 232 нм (r = + 0,95)

Выявлено, что антиоксидэнтная активность в плазме крови обожженных крыс в процессе течения ожоговой болезни по данным определения МДА-3 имеет колебательный характер, а величины МДА-3, характеризующие этот параметр, имеют отрицательнуюю корреляционную зависимость средней степени (r = - 0,57) с показателями, полученными при исследовании образцов . методом ЭПР-спектроскопии (отношение

ЭПР-сигналов церулоплазмина и трансферрина сыворотки крови у тех же крыс), То есть, максимальные значения МДА-З, обнаруженные по предложенному, способу, соответствуют минимальным значениям отношения ЭПР-сигналов церулоплазмина к трансферрину. Таким образом, вышеизложенное позволяет зэключаить, что возрастание концентрации МДА-3 соответствует снижению антиоксидантной активности исследуемой системы. Вероятно, более низкий уровень коэффициента корреляции, найденного для МДА-3, по сравнению с таковым для МДА-1, можно объяснить тем„что если концентрация МДА-3 отражает состояние общей антиоксидантной активности исследуемой системы, то отношение ЭПР— сигналов церулоплазмин/трансферрин—

1807410 только лишь часть антиоксидантного механизма, хотя и имеющего наиболее важное значение в сыворотке крови(т. е. систему церулоплазмин-трансферрин).

Сильная положительная корреляция (r = 5 .+ 0,76) показана для МДА-1 эритроцитов в сопоставлении с другим методом определения продуктов ПОЛ и характеризующим активность этого процесса — регистрацией конечных продуктов ПОЛ(шиффовых осно- 10 ваний) с помощью спектрофлуорйметра (см. табл.).

МДА-3 в эритроцитах имеет среднюю отрицательную корреляцию (г = - 0,46) с активностью фермента, обеспечивающего в 15 этих клетках наряду с другими энзимами антиоксидантный эффект, что также доказывает обратную зависимость между концентрацией в эритроцитах МДА-3 и антиоксидантной активностью системы за 20 счет супероксиддисмутазы (СОД); возрастание МДА-3 наблюдается при падении СОД, а его снижение — при подъеме активности этого фермента. Так как СОД является лишь частью антиоксидантной системы, связан- 25 ной с инэктивацией ПОЛ в эритроцитах, то, по-видимому, так же, как и в плазме, что объясняет средний уровень корреляции показателей, выявленный при анализе материала, полученного на одних и тех же 30 животных.

Таким образом, рассмотренный пример свидетельствует о достижении положительного эффекта при применении предложенного метода определения МДА для 35 характеристики s крови интенсивности процессов ПОЛ и состояния антиоксидантной системы, Способ может быть полезен и использован как в области практической (диагности- 40 ка глубины и тяжести патологических процессов, сопровождающихся интенсификацией процессов перекисного окисления липидов), так и экспериментальной медицинь1 и биологии, например, при исследовании 45 и оценке фармакологических эффектов лекарственных препаратов-антиоксидантов, различных физических факторов воздействия на организм, а также в токсикологии, рэдиобиологии и онкологии.

Формула изобретения

Способ определения малонового диальдегида в крови, включающий отбор крови, разделение плазмы и эритроцитов, добавление к исследуемой пробе раствора сернокислого железа в конечной концентрации

0,06 и тибарбитуровой кислоты, нагревание смеси с последующим спектрофотометрическим определением окрашенного продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности за счет возможности одновременного анализа интенсивности перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитах, а также характеристики состояния антиоксидантной активности этих систем, отбор крови производят в двух параллельных пробах, в первой в качестве антикоагулянта используют этилендиаминтетрауксусную кислоту, а во второй — гепарин, затем разделяют плазму и эритроциты, проводят гемолиз эритроцитов, в первую пробу плазмы и гемолизата эритроцитов добавляют этилендиэминтетрауксусную кислоту до конечной концентрации 0,5-1,5, во вторую пробу плазмы и гемолизата эритроцитов — сернокислое железо, пробы термоститируют, осаждают белок, после чего в образцах плазмы и гемолизата эритроцитов, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту, определяют малоновый диальдегид, нарастание которого свидетельствует о возрастании интенсивности процессов перекисного окисления. липидбв, а также разность оптической плотности второй и первой пробы соответственно в плазме и гемолизате эритроцитов и рассчитывают концентрацию малонового диальдегида, причем ее увеличение свидетельствует о снижении, а уменьшение — о возрастании антиоксидантной активности системы.

Х ! z сХ X

X 1

1

1 о

СЕ К

X S

c a

S (ф

X (- о

Я ((w (° (О

L (Q °

Р с

z o о (X

Э

xz: о

a (6 N

» (Х о 6

К

° ( о

Э М

° о х о (- Q. о )Y л 6 е с

z v

S 1 аа а с=

Э С» л «( о m о е

Х I(О»т

f- v

Y Z о

О.

lY

Э о

m X о z

Э сЧ

z м (:." с (е I(„-Y с э

X V

Х».

» с о

Э с

6 (Х

Э о

>5 л о х

Х X

)- (9

x e 0

) л

LA т

Ю

° {». л л

О

LA (»1 л

X

X (Х о

IЭ

1

I

1 !

I

I о

Y х

l» о

X

X (S о

m о

L о

ы о

S

z о

1Х

X с о

I

I

l СО и(I

I

I

1

I

X

Iо

m (т»

М -

«О (»

LA

Л О

° т т

co»% сл .-.

ВО лт

О с м, л С»

° т.l

"1 (: 6 т

X Э

)- lo о э

Z X ф

v (Q

X Z

I

1 т со

Ю (» м т л л (»1

М»-

-т «-«

° тv(X

X

О

Q. (т о о

l

I (о (о

1

I

I

I

3

l (» т

° {

D ет

О т л т е4 О -л

«Ю м т» т

X с

ы о о

IQ (Q

М т

О I

D »

«D

Ю т»!

«

Е)Л

L о

I М {» м л 1 м «

I

I

М

С(° т { с (I

X l

6 I

X l

О 1

С

«О т

Ст( о

Ю Ю ц»

° т

О»

О.

4 Ю

« ° м

1

I

1 х (О о

О .

С "

° т т,{» .

Ю лт—

° {»

D I

1 т

1 тт

Э

X е т

Э

S!

L !

K 2

m

S N л Э с о (Э л щ

v (Q о с х с о

Э .(3

Х

9 т э о

О. Х о m

)»

C с.z «îv

z а (v

z x а л . ф с

Э

К с о (Х Q. (X S

:(a е Э

X о е с е с

Э с X ({)

6 z

Z l-

Х

Э

z е о а О. о 4Ф и X

S Q ,5 (: о х

v s о )((» о

»

X о

Э и

I X

l ф

I с

) ф Е е о

I l- 11. о -eох с о о

l G. l{Э Х а (Q6ax

I О Z о

1

I т! ) CV

V 1! l

I Y !

О l е С s e

aox Q. (- Е 6 (х.хтэ

6(Q X

=1.. х е

I

1

1

1

I

1

I

3

l

1807410

m v о z с е

Е О.

Х 1L

S S о

I e

{» Х с z с(» X

Э е

z c

Х C

6 О

З о.»

Х а

l- Э о ={

X

v t

1(( ох

Y m х е е (Q к с е л

I f- l. xo ео

K (XX

Х

° X (х о а

z ao

X l- O

IQzC и О.& ойдо х а

v y f6

2 ° с

zvoe

Б)»т I1

S о

Х

ЭЮХ (Q

ХС Izo z

4 о л а (3

1.

v z

Y m «У охО

z (- a (- Y )X Е S

Е, О.

К (т» (Q м X! I- f- сХZvm уеоо

I

1

1 !

1

I

1

1

I

1

I !

I

I

l (I