Способ выявления сиаловых кислот в гистологических средах
Область использования: биология и медицина, а именно гистология, цитология, эмбриология, патоморфология, Сущность изобретения: проводят предварительное связывание терминальных остатков галактозы и М-ацетил-О-галактозамина путем инкубации срезов с нативными лектинами арахиса и сои, затем обрабатывают срезы лектином бузины черной, конъюгированным с пероксидазой хрена, а затем выявляют активность пероксидазы в системе диаминобензидин-Н2 02 и идентифицируют место локализации сиаловых кислот по наличию коричневоокрашенного продукта реакции.
сОюэ сОВетских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я) 5 G 01 N ЗЗ/50
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
1 (21) 4880255/13 (22) 06.11.90 (46) 15.04,93. Бюл, N 14 (71) Львовский государственный медицинский институт (72) А.Н,Яцковский. А,M.ßùåíêo, А,Д.Луцик и В.А. Антонюк (56) Quintarelli G., Scott 3,Å., Dellovo М,С, Histochemle, 1964, N 2, р, 90.
Shifuja N., Goldstein 1.J., Broekaert W.F„
et al. 1. B)ol, Chem. 1987, N 2, р, 1596. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СИАЛОВЫХ
КИСЛОТ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ
Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к гистологии, цитологии, змбриологии, патоморфологии, и может быть использовано для избирательного выявления сиаловых кислот в срезах тканей и органов.
Цель изобретения — повышение селективности выявления сиэловых кислот.
Существенным отличием предлагаемого способа является то, что для избирательного выявления остатков сиаловых кислот в составе молекул гликополимеров проводится предварительное блокирование свободных терминальных остатков D-галактозы и
N-ацетил-О-галактозамина нативными лектинами арахиса и сои, а затем выявляются остатки сиаловых кислот с помощью лектина бузины черной, коньюгированного с пероксидазой хрена.
Способ осуществляется следующим образом, Из фиксированной в 10% нейтральном формалине и заключенной в парафин
„„59„„1809386 А1 (57) Область использования: биология и медицина, а именно гистология, цитология, эмбриология, патоморфология, Сущность изобретения; проводят предварительное связывание терминальных остатков галактозы и К-ацетил-D-галактозамина путем инкубации срезов с нативными лектинами арахиса и сои, затем обрабатывают срезы лектином бузины черной, коньюгированным с пероксидазой хрена, а затем выявляют активность пероксидазы в системе диаминобензидин-Н202 и идентифицируют место локализации сиаловых кислот по наличию коричневоокрашенного продукта реакции, ткани готовят срезы толщиной 5 — 7 мкм. После депарафинации активность зндогенной пероксидазы ингибируют при инкубации срезов в метаноле, содержащем 0,3% Н202, и через спирты нисходящей концентрации доводят до забуференного физиологического раствора (ЗФР). Обрабатывать лектином можно и криостатные срезы, которые готовят конвенциональными методами. С целью блокирования субтерминальных остатков
D-галактозы и N-ацетил-D-галактозаминэ перед обработкой срезов меченым лектином бузины черной проводится их инкубация в растворах нативных лектинов (не коньюгированных с пероксидазой) арахиса и сои в течение 30 мин при концентрации лектина в инкубационной среде 50 мкг/мл.
После отмывания избытка лектинов арахиса и сои в двух порциях ЗФР срезы обрабатывают коныюгатом лектина бузины черной с пероксидазой, активность пероксидазы проявляют с помощью диаминобензидина в
1809386 присутствии 0,0015 HzOz. Избыток преципитата хромогена удаляют в двух порциях
Н О, препараты заключают в сироп Апати либо, после дегидратации, в нейтральный канадский бальзам.
Пример, Из фиксированной в 10 нейтральном формалине и заключенной в парафин поднижнечелюстной слюнной железы овцы готовят срезы толщиной 7 мкм, помещают их в каплю дистиллированной воды на обезжиренное предметное стекло и высушивают в термостате при 42 С в тече. ние 24 — 72 часа. Затем срезы депарафинируют, инкубируют 30 мин в метаноле, содержащем 0,3 HzOz и через спирты нисходящей концентрации доводят до ЗФР (состав ЗФР: 1 л Н О, 80 г NCI, 1 г NaHP04, 0,2 г KCI рН доводят до 7,5 с помощью 1 н
HCI). После этого срезы инкубируют 30 мин в растворах нативных лектинов сои и арахиса (не конъюгированных с пероксидазой).
Избыток лектинов арахиса и сои удаляют путем двухкратного промывания срезов в
ЗФР. Затем 45 мин срезы инкубируют в
ЗФР. содержащем 100 мкгlмл лектина бузины черной, меченого пероксидазой, и отмывают в двух порциях ЗФР. Визуализацию рецепторов лектина бузины черной осуществляют путем инкубации срезов в ЗФР, содержащем 0,05 диаминобензидина тетрагидрохлорида и 0,15 Н 02 в течение 3 мин.
Активность пероксидаэы, связанной посредством молекулы лектина с остатками сиаловых кислот гликоконьюгатов, выявляют по коричневым отложениям преципитата окисленного диаминобензидина. После удаления избытка хромогена в двух порциях HzO препараты заключают в нейтральный канадский бальзам. В местах локализации сиалогликанов после проявления описанной гистохимической реакции появляется насыщенная коричневая окраска. В местах, лишенных сиалогликанов, окрашивание отсутствует, В таблице представлены результаты сравнения эффективности различных способов выявления сиалогликанов в поднижнечелюстной железе овцы, Из таблицы видно, что при обработке гистологических препаратов поднижнече30 ареактивны
5
25 люстной слюнной железы овцы 1 раствором альцианового синего при рН 2,5 очень значительно окрашиваются мукоциты, умеренно выраженную реакцию дают сероциты, кроме того окрашиваются и другие. структурные элементы железы (коллагеновые и эластические волокна, десмоциты).
При проведении метилирования при 37 С с последующей окраской препаратов альциановым синим очень интенсивно окрашиваются мукоциты, умеренно выраженную или слабо положительную реакцию дают сероциты и другие структурные компоненты железы, Обработка гистологических срезов лектином бузины черной, конъюгированным с пероксидазой дает интенсивную реакцию. со стороны мукоцитов, кроме того умеренно окрашиваются сероциты и другие структурные компоненты железы. Обработка препаратов нативными лектинами арахиса ui сои, связывающими терминальные остатка 0-галактоэы и N-ацетил-О-галактозамина, с последующей окраской лектином бузины черной, конъюгированным с h8poKсидазой, содержащих значительное количество сиаловых кислот, дает интенсивную реакцию со стороны мукоцитов, что и обеспечивает повышение селективности, остальные структурные компоненты железы
Предлагаемый способ обладает большей селективностью по сравнению с известными, более удобен в техническом исполнении, позволяет .дифференцировать сиалогликаны от других кислых гликопротеинов.
Формула изобретения
Способ выявления сиаловых кислот в гистологических срезах, включающий обработку срезов лектином бузины черной, коньюгированным с пероксидаэой хрена. о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения селективности способа, перед обработкой срезов лектином бузины черной их инкубируют в смеси нативных лектинов арахиса и сои, а сиаловые кислоты выявляют по коричневому окрашиванию после обработки диаминобенэидина тетрагидромлоридом.
1809386
Паренхима железы
Соединительнотканна строма
Фон
Способ выявления сиалогликанов
Мукоциты
Сероциты
Клетки выходных протоков
Волокнистые структуы
Аморфное вещество
Популяции десмоцитов
Аналоги:
Альциановый синий рН 2,5
Метилирование
/37 С/ + альциановый синий
Метили рование . /60 С/ + омыление +
+альциановый синий
Метилирование
/60 С/ + альциановый синий
Прототип:
Лектин бузины черной, коньюгированный с пероксидазой
Предлагаемый способ:
Нативный лектин арахиса и сои+ лектин бузины черной, коньюгированный с перокси азой
+++
++ +
+++
Составитель И. Тареева
Редактор В, Трубченко Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор И.Шмакова
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
Заказ 1284 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
