Способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях
Использование: в медицине, при токсикологических , биофармацевтических и фармакокинетических исследованиях в клинических лабораториях. Цель - повышение чувствительности, специфичности и снижение токсичности способа. Пробу крови или мочи подвергают электрофорезу на бумаге с последующей обработкой электрофореграммы реактивом и раствором хлороводородной кислоты с рЙ 2,0-2,5 и обнаружением клофелина подлине пути фореза. Использование изобретения позволяет повысить чувствительность реакции примерно в 3-4 раза и идентифицировать клофелин в присутствии других лекарственных веществ сопутствующей терапии.
союз советских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я>з G 01 N 33/50
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
llPN ГКНТ СССР
?) lAH) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4772963/14 (22) 28.11.89 (46) 07.07.92. Бюл. М 25 (71) Тюменский государственный медицинский институт (72) Б.Н.Бекетов и Г;А.Лисионкова (53) 616.07 (088,8) (56) Суд. мед, экспертиза, 1983, М 4, с. 3638. (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ KflOcDEflVIHA В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (57) Использование: в медицине, при токсикологических, биофармацевтических и фарИзобретение относится к области меди цины, а именно к способам обнаружения клофелина (гемитона, катапресана, клонидина), и может быть использовано при ток- сикологических, биофармацевтических и фармакокинематических исследованиях в условиях клинических лабораторий.
Целью изобретения является повышение чувствительности, селективности и снижения токсичности способа обнаружения клофелина в биологических жидкостях (кровь, моча).
Пример 1. Исследование крови (модельный опыт), 10 мл крови, содержащей 1000 мкг клофелина, после инкубирования в течение 24 ч при комнатной температуре смешивают с 25 мл воды и оставляют для гемолиза на 20 мин. После добавления по каплям при перемешивании 9 мл 20%-ного раствора трйхлоруксусной кислоты раствор нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч в колбе с обратным холодиль Ы2 1746314 А1 макокинетических исследованиях в клинических лабораториях. Цель — повышение чувствительности, специфичности и снижение токсичности способа, Пробу крови или мочи подвергают электрофорезу на бумаге с последующей обработкой электрофореграммы реактивом и. раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0 — 2,5 и обнаружением клофелина по длине пути фореза, Использование изобретения позволяет повысить чувствительность.реакции примерно в 3 — 4 раза и идентифицировать. клофелин в присутствии других лекарственных веществ сопутствующей терапии.
I
1 ником или 30 мин на глицериновой бане (140 + 50С). После охлаждения гидролизат центрифугируют при 5000 об/мин 5 мин и надосадочную жидкость сливают в колбу.
Осадок трижды промывают 10 мл раствора а хлороводородной кислоты (5 мл конц. уд. вес. 1,19+ 95 мл воды) с последующим цен- д„ трифугированием. Надосадочные жидкости объединяют, .подщелачивают до рН 9-10
25%-ным раствором гидроксида аммония и экстрагируют хлороформом (25 мл х 3) в течение 20 мин. Образующуюся эмуль- 4 сию разрушают центрифугированием п ри 5000 об/мин. Экстракты отделяют, хлороформ испаряют при комнатной температуре до остаточного объема-2 мл.
На полоску хроматографической бумаги марки M (15 х 29 см) наносят по 0,02 мл растворов экстрактов модели крови, контроля крови (извлечение соэкстрактивных веществ проводят из 10 мл крови по описанной методике), раствора "свидетеля" содержащего 10 мкг клофелина. Диаметр
1746314 начального пятна 0,3-0,5 см, расстояние фаром, феназепамом, анаприлином, циннамежду точками нанесения 2 см. Электрофо- ризином, подкисляют до рН 1, концентриез проводят в течение 1 ч при напряжении рованной хлороводородной кислотой и
400 В, в модифицированных камерах к при- нагревают на глицериновои бане (1 0 С) б ПЭФ-3. Начальная температура элект- 5 в колбе с.обратным холодильником. После ору ролита 20 С. охлаждения гидролизат подщелачивают до
Электролит —, универсальный буферный рН 9-10 25% ным раствором, гидроксида раствор Бриттона-Робинсона рН 1Я, Элекг аммония и экстрагируют хлороформом в терофореграммы.(ЭФГ) высушивают на возду- чение 20 мин (10 мл х 3), Образующуюся хе и обрабатывают последовательно 10 эмульсию разрушают центрифугированием модифицированным реактивом Драгендор- при 5000 об/мин 5 мин. Экстракты отделяфапо Бертгоффу-Дельвичеирастворомхло- ют, хлороформ испаряют при комнатной оводородной кислоты с рН 2,0 — 2 5. температуре до остаточного объема 2 мл, роводор дн
Обнаружение окрашенных в темно-серый Параллельно по даннои методике были оли цв вет зон клофелина на светло-сером фоне 15 учены экстракты из мочи: модельный опыт ро одят по длине пути фореза (ДПФс ) — (1000 мкг клофелина в 100 мл мочи, контН о расстояние от линии старта до переднего рольный опыт 100 мл мочи больного до края зоны, в сравнении с ДПФсм "свидете- приема клофелина. ля". Чувствительность реакции обнаруже- На линию старта полосы хроматограния клофелина 0,3 — 0,5 мф в. пробе. При 20 фической бумаги марки М (15 х 29 см) наобработкеЭФГподанной1 етодикеобнару- носят в три отдельные точки по 0,05 мл женные зоны клофелина содержащие 10 растворов экстрактов: модели мочи, контмкги более,имеюттемно-серыйцветс крас- роля мочи и мочи больного.. В четвертую новатым оттенком, интенсивность которого точку наносят "свидетель" — клофелин, в зависит от концентрации препарата. Пре- 25 пятую: клофелин и смесь веществ, сопутстдел обнаружения составляет 50 мкг клофе- вующей терапии (коринфар, феназепам, лина на 10 мл объекта.. анаприлин, циннаризин). Диаметр начальПример 2. Исследование мочи (мо- ного пятна 0,3-0,5 см, расстояние от края дельный опыт). ЭФГ не менее 1,5 см, расстояние мйкду
199 мл мочи, содержащей 1000 мкг кло- 30 точками нанесения 2 см. Электрофорез профелина, после 24 ч инкубирования при ком- водят при избранных условиях (пример 1) натной температуре подкисляют до рН 1.0 ЭФГ высушивают на воздухе. В УФ-свете концентрированной хлороводородной кис- отмечают локализацйю зон веществ, обла.лотой и нагревают на кипящей водяной бане дающих свечением. По характеру свечения в течение 1 ч в колбе с обратным холодиль- 35 (коринфар желто-зеленого. феназепам желником или 30 мин на глицериновой бане - тое, анаприлин фиолетовое. циннаризин (140 — 5 С). После охлаждения гидролизат светло-фиолетовое) и ДПФ, проводят .подщелачивают до рН 9 — 10 25%-ным рас- идентификацию этих веществ. При значетвором гидроксида аммония и экстрагируют нии рН электролита 1,8 клофелин в УФ-свехлороформом (40 мл х 3) в течение 20 мин. 40 те не флюресцирует. После обработки
Образующуюся эмульсию разрушают цент- модифицированным реактивом Драгендоррифугированием при 5000 об/мин 5 мин, фа по Бертгоффу-Дельвиче тотчас обрабаЭкстракты отделяют, хлороформ испаряют тывают раствором хлороводородной при комнатной температуре до остаточного кислоты с рН 2,0 — 2,5 до перехода оранжевообьема 2 мл. Очистку хлороформного экс- 45 го окрашивания фона в светло-серое, зона тракта мочи и обнаружение зон клофелина клофелина при этом окрашивается в темнопроводят электрофорезом на бумаге по ме- серый цвет, тодике, описанной в примере 1. Для нанесе- Идентификацию окрашенных зон иссния на ЭФГ используют по 0.02 мл ледуемыхвеществпроводятпо ДПФ м. Харастворов модели мочи, контроля мочи (из- 50 рактер окрашивания и ДПФсм клофелина— влечение соэкстрактивных веществ прова- "свидетеля" и клофелина, выделенного из дят из 100 мл мочи по описанной методике), мочи больного, идентичны и равна 9,7 см. раствора "свидетеля", содержащего 10 мкг При исследовании клинического материала клофелина. Предел обнаружения составля- (моча) было установлено, что обнаружению ет 50 мкг клофелина на 100 мл объекта, 55 и идентификации клофелина не мешаюттакПример 3. Исследование мочи (кли- же вещества, назначаемыесовместносним: нический материал). триампур, агапурин, фентоламина гидро100 мл мочи больного Н, принимавшего хлорид, курантил. в течение 18 сут клофелин в терапевтиче- Изучено влияние рН раствора хлоровоскихдозах(0,075 мгх 3) в сочетании с корин- дородной кислоты на характер окрашива174б314
Составитель В.Митюшин
Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Король
Редактор Н.Бобкова
Заказ 2392 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 ния зоны и фона. Установлено, что при значении рН от 2,0 до 2,5 данная реакция обнаружения обладает максимальной чувствительностью.
Обнаружение клофелина при данной 5 чувствительности возможно при использо. вании хлороводородной, азотной и серной кислот и невозможно в присутствии фосфорной и уксусной. Выбор в качестве детектирующего реагента хлороводородной 10 кислоты обусловлен ее доступностью и меньшей токсичностью.
Таким образом, предлагаемый способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях высокочувствителен, нетокси- 15 чен, селективен, так как позволяет дифференцировать препарат в присутствии лекарственных веществ сопутствующей терапии, Кроме того, предлагаемый спо. соб позволяет повысить чувствительность 20 реакции по сравнению с известным способом (в известном чувствительность реакции
10 — 15 мкг, в предлагаемом 0,3 — 0,4 мкг в пробе), Формула изобретения
Способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях путем изолирования подкисленной водой, проведения гидролиза, экстракцию органическим растворителем с последующим разделением компонентов пробы и обнаружением кло-,ф фелина после обработки реактивом Дра- гендорфа по Бертгоффу-Дельвиче, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности, специфичности и снижения токсичности способа, разделение компонентов пробы. проводят электрофорезом на бумаге с последующей обработкой электрофорограммы реактивом и раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0-2,5 и обнаружением клофелина по длине пути фореза.
