Способ определения наличия злокачественного процесса

 

Использование: при диспансеризации населения с целью выявления больных со злокачественными новообразованиями. Цель: повышение точности и расширение функциональных возможностей способа. Сущность изобретения: в сыворотке крови определяют магнийнезависимую ДНКазную активность при рН 5,0-7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции. При ДНКазной активности определяют наличие злокачественного процесса , а при отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности и одновременном повышении показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Ей более определяют наличие злокачественного процесса с метастазированием. Положительный эффект высокая чувствительность при достаточной точности

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕ ННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ табл, (21) 4487110/14 (22) 26,09.88 (46) 23.11.92, Бюл. ¹ 43 (71) Ростовский научно-исследовательский онкологический институт (72) Ю.С, Сидоренко, Н.Д, Кислякова, Г.Я, Чернявская, Г.А. Попова, Г.Я. Марьянов. ская, Г.А. Неродо и С,А. Зинькович (56) Биохимические исследования в клинике. Л.: Медицина, 1976, с. 30-41.

Врачебное дело, 1959, N. 3, с, 253. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ

ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ПРОЦЕССА (57) Использование: при диспансеризации населения с целью выявления больных со злокачественными новообраэованиями.

Цель: повышение точности и расширение

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической онкологии, и может быть использовано при диспансеризации населения с целью диагностического выявления методом выбора (скриннинга) больных со злокачественными новообразованиями, независимо от стадии и локализации опухолевого процесса.

Известен способ диагностики злокачественных новообразований путем определения активности ферментов в сыворотке крови человека: изменение изоферментного спектра фермента лактатдегидрогенаэы (ЛДГ). При сопоставлении активности изоферментов ЛДГ, а именно ЛДГ5 и ЛДГ1, определен термин "индекс малигнизации", значение которого при злокачественном росте опухолей превышает единицу. Однако широкое использование этого способа диагностики лимитировано сложностью выпол, >5U„1777080 А1 функциональных возможностей способа, Сущность изобретения: в сыворотке крови определяют магнийнезависимую ДНКаэную активность при рН 5,0 — 7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции. При ДНКазной активности определяют наличие злокачественного процесса, а при отсутствии магнийнезависимой

ДН Казной активности и одновременном повышении показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процесса с метастазированием, Положительный эффект: высокая чувствительность при достаточной точности (82,7%) обеспечивает высокую степень выявляемости онкологических заболеваний. 2 нения исследований, проводимых в клинико-диагностической лаборатории.

Известен способ ранней диагностики злокачественных новообразований путем определения в сыворотке активности фермента ДНКэзы 1, оптимальное действие которого выявляется в слабо щелочной среде (рН 7,4) при обязательном присутствии ионов магния. Активность ДН Казы 1 в сыворотке крови человека определяют вискозиметрически по изменению вязкости коллоидного раствора ДНК после действия на него фермента. Находят относительную вязкость опытной пробы по отношению к воде до 2-часовой инкубэции в термостате и после нее. Опытная проба состоит из реакционных компонентов: сыворотки крови, натриевой соли ДНК и раствора MgS04 (ионы магния), т.е. реакция идет в присутствии ионов магния в слабо щелочной-средерН крови 7,4, Активность фермента выража 3

1777080 ют в относительных единицах — угловых градусах: угол 90 означает, что относительная вязкость опы гной смеси за время инкубации не изменилась, т,е, активность фермента ДН Казы 1 отсутствует. В сыворотке крови 5 доноров (здоровые лица) активность ДНКаэы 1 отсутствует. Клинически выраженный рак ill-И стадии также характеризуется отсутствием активности ДНКазы 1, При наличии активности ДНКазы 1 в 10 сыворотке крови диагностируют рак только на ранних стадиях (!-!!), Этот способ не находит широкого применения для диагностики рака, так как имеет ряд существенных недостатков: 15

1. Выявляемость рака составляет всего . 48,2 : из 29 случаев рака положительная активность ДН Казы 1 в сыворотке крови обнаружена только у.14 человек, 2. Отсутствует выявляемость III — И ста- 20 дии рака. особенно при недостаточно выраженной специфической симптоматике злокачественного роста.

3. Невозможно вискозиметрическое определение показателя количественного со- 25 держания нерхлорнорастворимой фракции, 4. Способ не пригоден для диагностического выявления саркоматозных опухолей, при которых активность фермента чаще не выявляется, 30

5, Большие затраты времени на проведение анализа: время подготовки анализа, 2-часовая инкубация в термостате, по 5-6 отсчетов времени вытекания жидкостей в вискозиметре до и после инкубации, по- 35 строение графика, Целью изобретения является повышение точности и расширение функциональных возможностей способа.

Поставленная цель достигается тем, что 40 определяют в сыворотке крови обследуемого лица магнийнезавиоимую ДНКазную активность при рН 5,0-7,5 и одновременно показатель количественного содержания перхлорнорастворимой фракции (ПФС) 45 спектрофотометрическим методом при

260 нм, При наличии магнийнезависимой

ДНКазной активности и нормальном или повышенном показателе количественного содержания перхлорнорастворимой фрак- 50 ции диагностируют наличие злокачественного процесса, при отсутствии магнийнезависимой ДН Казной активности и одновременном повышении показателя количественного содер>кания перхлорнора- 55 створимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процесса в запущенной стадии развития, т.е, с метастазированием; при отсутствии магнийнезависимой ДН Казной активности и нормальном показателе количественного содержания перхлорнорастворимой фракции определяют отсутствие злокачественного процесса.

Сравнение чувствительности на рак по стадиям заболевания по предлагаемому способу и и рототи пу иллюстри руется табл,1.

Способ осуществляется следующим образом.

Процедура проведения анализа. Анализ можно производить, только если больной в ближайшие 3 — 5 месяцев не получал фитотерапии, химио- и лучевой терапии, не проводил самолечение ядами (например, сулемой, креолином и т,д.), а также не принимал биологически активных веществ (гормонов, нуклеотидов, адаптогенов и т.д.).

I. Подготовка анализа, а) Приготовление extempore 0,05 Д раствора ДНК на 0,1 M ацетатном буфере: слегка перемешав коллоидный раствор ДНК, ставят его на ледяную баню на 1 ч, изредка перемешивая мягким встряхиванием. Все растворы и штативы с пробирками держат на ледяной бане и хранят в холодильнике, Затем раствор ДНК перед употреблением щадя ще центрифуги руют. б) Подготовка сыворотки; забор крови производят натощак свободным вытеканием (одной только иглой), Сыворотку быстро отделяют и дер>кат на ледяной бане. Перед употреблением ее разводят ледяным физраствором в 10 раэ (1;9 по объему), перемешивают путем сильного встряхивания и отсасывают пастеровской пипеткой образующуюся пену, которую отбрасывают. Разведенную сыворотку держат на ледяной бане.

II, Проведение анализа.

1). Разлив реактивов производят в полиэтиленовые пробирки (объемом 3,5 — 4 мл) в ледяной бане s следующем составе и порядке: а) опытные пробы; (5 параллелей) — к

1 мл 0,057 раствора ДНК приливают 1 мл разбавленной в 10 раз сыворотки; б) контроль I(5 параллелей) — на содержание нуклеотидов в растворе ДНК: к 1 мл физраствооа приливают 1 мл 0,05 раствора ДНК. в) контроль II (5 параллелей) (на количественное содержание перхлорнерастворимой фракции в сыворотке крови); к 1 мл ацетатного буфера приливают 1 мл разбавленной в 10 раз сыворотки крови;

2), Инкубация после перемешивания путем тщательного встряхивания всех проб при 37 С в течение 30 мин на водяной бане.

3). Остановка ферментативной реакции путем быстрого помещения всех проб в ледяную баню и быстрого добавления в ка» .

1777080 дую пробу по 1 мл раствора НС!04(до конечной концентрации в реакционной смеси

0,5 М НС!04). После тщательного встряхивания пробы оставляют на 1 ч в ледяной бане для лучшего формирования осадка.

4). Центрифугирование при 4000 об/мин в течение 10 мин, 5), Слив надосадочной жидкости и спектрофотомегрирование при 260 нм.

6), Расчет магнийнезависимой ДНКазной активности и выражения показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции сыворотки(ПФС) крови;

a) рассчитывают истинную оптическую плотность в экстинкциях опытной пробы (ЬЕ,) путем вычитания из среднеарифметического показателя оптической плотности опыта суммы среднеарифметических пока."-ателей плотности обоих контоолей и II no формуле

hEo — — Ео - (Ек!+ Еки), Обнаружение положительной ферментативной активности следует считать со значения

ЛЕ = 20 Е и выше с учетом расхождения в параллельных пробах (+.10Е) и возможной ошибки прибора (+5- 10 Е), ДНКазную активность условно можно выражать B величинах Л Ео в экстинкциях.

По международной системе СИ производят расчет в мкмоль/(л мин) кислоторастворимых нуклеотидов, образовавшихся за 1 мин инкубации 1 л сыворотки крови с субстратом ДНК, Количество мкмолей кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК находят по калибровочной кривой, построенной для АМФ или по коэффициенту пересчета К, выведенному по этой кривой.

Расчет по формуле:

АЕр х 10000 х К

30 где 10000 — пересчет объема 0,1 мл сыворотки крови в реакционной смеси на 1 л сыворотки; 30 — количество минут инкубации проб.

Показателем количественного содержания перхлорнорастворимой фракции в сыворотке крови (ПФС) служит среднеарифметический показатель оптический плотности контроля II, выраженный в экстинкциях.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная В., 1933 года рождения, ист. болезни ¹ 2334/м, прооперирована в гинекологическом отделении

Ростовского НИИ онкологии. с диагнозом: рак тела матки, стадия II; гистоанализ: аденокарцинома тела матки с инвазией мышечного слоя (¹ гистоанализа: 290 269 — 78).

30 процесса. состоит в его высокой чувствител ь ности (96%) и ри достаточ ной точ ности

40

55

Диагностический анализ крови до операции: от 15 03 88

ДНКазная активность 0,756 л к моль/л/мин, показатель ПФС вЂ” перхлорнорастворимой фракции сыворотки 0,162 Е.

Пример 2. Больная М., 1922 года рождения, история болезни ¹ 7073/Ф, прооперирована в институте, в гинекологическом отделении, с диагнозол1: кистома правого яичника и миома матки (¹ гистоанализа 236 496 — 502).

Диагностический анилиз: кровь до операции от 22.06.88.

ДНКазная активность 0; показатель

ПФС 0,065 Е.

Пример 3. Больная Т„1935 года рождения, ¹ ист. болезни 501/Ф. прооперирована в гинекологическом отделении института с диагнозом: рак яичников, стадия

И. Гистоанализ ¹ 228 566 — 79: цистоденокарцинома с метастазами в большой сальник. Диагностический анализ крови от

14.01.88 до операции: ДНКазная активность

О. показатель ПФС 0,218 Е.

Доказательства положительного эффекта. предлагаемого способа представлены в табл 2.

Эффективность способа диагностики, способа определения злокачественного (82,7%) к наличию злокачественного роста в организме больного и, следовательно, высокой степени выявляемости онкологических заболеваний. Заявляемый способ отличает. ся простотой выполнения, небольшой затратой времени (на обследование 2 — 4 человек не более 3 ч) — анализы идут параллельно, не требуют использования сложной, уникальной аппаратуры, и может найти широкое применение при диспансеризации населения как диагностический метод скриннинга (выбора) по определению наличия злокачественного новообразования в организме человека с целью выявления лиц, нуждающихся в тшательном онкологическом обследовании и дальнейшем проведении специфического лечения, Формула изобретения

Способ определения наличия злокачественного процесса путем биохимического исследования сыворотки крови, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности и расширения функциональных возможностей способа, в сыворотке крови пациента определяют магнийнезависимую

ДНКазную активность при рН 5,0-7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции спектрофотометрически при 260 нм, и при ДНКазной активности

1777080 держания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процесса с метастазированием.

Табли а 1 определяют наличие злокачественного процесса, а при отсутствии магнийнезависимой

ДН Казной активности и одновременном повышении показателя количественного со!

Таблица

Количество ложноотрицательных и ложнополо>кительных ответов по диагностическим ана-. лизам, выполненным предлагаемым способом 11

Злокачественные опухоли

Доброкачественные опухоли, хронические воспалительные и оцессы

Локализация

С гистоанализом

Общее количество больных

Общее количество больных

С гистоанализом

Совпадение

Несовпадение (ложноотрицательные ответы

Совпадение

15 (100 O ) 34 (97 1 ) 1 (2 9%) 30 (88%)

14 (43 ) 34

4 (12%)

19 (57%) 33

14 (59%) 3

19 (100%)

40 {91%) 5

24

10 (41%) 4 (9%) Отлельнь1е rnuuAM

Редактор Г, Бельская Техред М.Моргентал

Заказ 4120 Тира>к Подписное

ВНИИПИ i осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Желудочно-кишечный тракт

Тело и шейка матки

Яичники

Легкие

Молочная . железа

Рак вульвы и лейкоплакия

35 (30— карцинома и 5 — саркома)

19

44

Несовпадение (ложноотрицательные ответы