Способ стимуляции нейросекреторных клеток гипоталамуса в эксперименте

 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Способ позволяет повысить эффективность стимуляции. Для этого вводят дистагмин в дозе 1 г/кг массы тела.3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю A 61 К 31/04

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) 1ÈÈ3 ц3 ; /» "», =» Ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (21) 4902751/14 (22) 18.01.91 (46) 30.04.93. Бюль+ 16 (71) Санкт-Петербургский государственный университет (72) В.Б,Прозоровский, И.M,Ñóñëîâa и В.Г.Скопичев (56) Мс11 R.A„Barcer J,1 . "The pharmacology

of recurent inhibition in the supraoptic

ncurosccrctory sistern" — Brain Rcs., 1971, 35, р.501.

Предлагаемое изобретение относится к области медицины. Известно, что продуцируемый нейросекреторными клетками супраоптического ядра окситоцин, выделяясь в кровь, стимулирует сокращения матки и способствует выведению молока у лактирующих животных и человека, Высвобождение окситоцина обеспечивается воздействием ацетилхолина в области аксовазальных контактов, но тормозится при воздействии ацетилхолина в области тел нейронов на уровне гипоталамуса. Таким образом, регуляция высвобождения окситоцина может быть осуществлена за счет избирательного накопления ацетилхолина на разных уровнях нейросекреторного процесса, Решение данной задачи облегчается тем, что организация ядер гипоталамуса обеспечивает размещение различных частей нейросекреторного механизма в раЗных отделах мозга.

Целью данного изобретения явилось увеличение эффективности стимуляции и предупреждения тормозного действия ацетилхолина непосредственно на тела нерв5U 1811843 А1 (54) СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ НЕЙРОСЕКРЕТОРНЫХ КЛЕТОК ГИПОТАЛАМУСА В

ЭКСПЕРИМЕНТЕ (57) Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Способ позволяет повысить эффективность стимуляции. Для этого вводят дистагмин в дозе 1 10 г/кг массы тела. 3 табл.

Оных клеток. Поставленная цель достигается тем что в известном способе применяются антихолинэстеразные препараты типа

"Прозерин", а предлагаемом способе использовался гексаметилен-бис 311-метилкар бам и н о вой кисл от ы — 2 — /2 — диметил-, аминометил пиридинового эфира, далее условно называемого "дистагмин". Название; связано с тем, что молекула данного сое- QQ динения представляет собой сдвоенную в молекулу фармакопейного препарата "Аминостигмин

QO

Изобретение соответствует критерию д новизна, поскольку по сравнению с про- тотипом у предлагаемого для стимуляции выведения окситоцина соединения существенно иная химическая формула.

Изобретение соответствует критерию а существенные отличия, поскольку использование антихолинэстеразного средства иной структуры придало заявляемому феномену новые свойства: освобождение окситоцина стало более стабильным в результате меньшей проницаемости предлагаемого соединения через ГЭБ, менее опасным, по1811843 скольку его токсичность при сохранении антихолинэствразной активности на том же уровне резко снизилась, Возможность достижения желаемого эффекта доказывается следующими примерами

Пример 1. Антихолинэстеразная активность.

Антихолинзстеразную активность определяли в опытах "ин витро". Как заявляемое соединение, так и прототип прозерин относятся к группе обратимых ингибиторов хо.линзстеразы и их взаимодействие с ферментом проходит по единой схеме, в которой на первом etane электроэквивалентное взаимодействие участников реакции определяется константой сродства — Ka, а на втором — карбамилирование фермента остатком кэрбаминовой кислоты — константа карбамилирования — К . Суммарная бимолекулярная константа Kz, определяет . общую ингибирующую способность препарата. Константы определяли графически rio методу Прозоровского и соавт. (Фармакол. и токсикол. 1978, Т.22, N. 4, 1035 — 1037), В качестве фермента использовали очищенную эцетилхолинэстеразу эритроцитов человека с удельной активностью

1,2-1,9 Е/мг. Скорость гидролиза ацетилхолина определяли методом непрерывного потенциометрического титрования на автотитраторе TTT-1с фирмы "Radiometer" при постоянной величине рН 7,4. Растворы изучаемых веществ в различных койцентрациях прибавляли к ацетилхолинэстеразе, Смесь инкубировали при постоянной температуре 37,4 С. Регистрйровэли скорость гидролиза в интервале 1 — 6 мин, Найденные значения коэффициентов; характеризующих реакцию фермента с ацетилхолином в присутствии ингибиторов приведены в табл,1, Пример 2, Токсические дозы для животных.

О токсическом действии заявляемого соединения и,прототипа судили по велйчине летальных и токсических доз, которые определяли экспресс-методом В.Б.Прозоровского и соавт.(Фэрмакол, и токсикол.).

Полученные результаты приведены в табл.2.

Согласно данным таблицы заявляемое соедийение в 84-32 раза менее токсичен по летальным дозам и в 100-430 раз по дозам токсическим, Существенно, что у кошек различия в токсичности выражены сильнее, чем у грызунов. Существенное возрастание разницы между препаратами при оценке по токсическим эффектам связано с более выраженным мышечным (фэсцикуляторным) свойствам прозерина. Большее сродство

10 прозерина к холинореэктивным .системам мышцы по сравнению с заявляемым соединением определяется наличием в составе

er0 молекулы четвертичного азота.

Отношение летальных доз при в/в введении к в/ц для заявляемого соединения составляет 2,3, а для прозерина 1,4, что свидетельствует о меньшей разнице доз для прототипа, следовательно, большей его способности проникать через ГЭБ.

Отношение доз, вызывающих токсические центральные эффекты, к дозам, вызывающим токсические периферические эффекты у прототипа в 1,7-4,0 раза больше, 15 чем у заявляемого соединения. Эти данные свидетельствуют о том, что при попытке получить центральный эффект возникающие от малых доз периферические эффекты прототипа будут мешать его практическому

20 . применению.

Выводы из примера 2: Заявляемое соединение менее токсично, чем прототип, оно хуже проникает через ГЭБ и не обладает. высоким сродством к нервно-мышечным синапсам, в результате чего его побочное периферическое действие проявляется s меньшей степени.

Пример 3, Состояние нейросекреторных клеток супраоптического ядра {СОЯ) ги-30 поталамусэ.

Результаты морфометрического анализа отражающего значения функционального состояния клеток СОЯ, вполне определено говорят о стимуляции секретор35 ного процесса в случае действия "дистагмина" и подавлвнии реакции при действии прозерина. Примечательно, что действие

: высоких доз бизерина приводит к снижеиию эффекта энтихолинэстеразного дейст-:

40 вия и вполне очевидно, в этой сверхвысокой дозировке его действие опосредуется на уровне лежащих зэ гематоэнцефэлическим барьером образовэнйй гипоталамуса.

Морфологический анализ проводили на

4Б крысах весом 200-250 r, Внутрибрюшинно крысам вводили; прозерпин (прототип) a äîзах 1 10 г/кг; 1 10 г/кг, 1 10 г/кг и заявляемое вещество дистогмин в дозах

1.10 г/кг, 5.10 r/êã, 1 10 r/êã. Через

40: мин после введения ингибиторов геолинзстераз Kpbtcbl декопитировались и фрагменты головного мозга фиксировали в жидкости Буэна. Серийные фронтальные среды мозга толщиной 5 мкм окрашивали

%- параальдегидфуксином с докрэской азокармином по Гомори-Гобу, На гистологических препаратах опытных и контрольных (с введением плацебо), определяли объем ядер и тела нейросекреторных клеток по формуле:

1811843 дд Б2 ч— используемой для структур, приближающихся к эллипсоидам вращения. где: Ч вЂ”. объем ядра, А — больший и Б — меньший диаметры, Наличие связи клеточного метаболизма и изменениями объема нейросекреторных клеток мы связываем с поступлением в клет. ки осмотически активных веществ — сахаров, Транспорт сахаров определяли по входу неутилизируемого сахара Д-ксилозы. являющегося аналогом глюкозы. Фрагменты гипоталамуса инкубировапи в среде, содержащей 0,5 % растворы Д-ксилозы и сахарозы. Ткань гипоталамуса обсушйвали, кипятили в дистиллированной воде и в без..белковом экстракте определяли Д-ксилозу 20 по методу Роя и Райса (Яое, Rice, 1948).

Вход сахара рассчитывали, как разность . между ксилозным и сахарозным пространством.

Особенностью этой части работы яви- 2о лось то, что фрагменты гипоталамуса, содержащие супраоптическое ядро, получали от взрослых животных и инкубировали во влажной камере. Применение переживающей кудьтуры фрагментов гипоталамуса 30 требует обоснования некоторых функциональных характеристик, Цитоархитектоника переднегипоталамической области такова, что при выделений супраоптическо. го ядра неизбежно перерезаются аксоны, 35 составляющие гипоталамо-гипофизарный тракт, и это может являться причиной серьезных нарушений деятельности нейросекреторных клеток, поскольку выпадает значительная часть функционально обус-. 40 ловленных процессов, Однако; проведенные в нашей лаборатории эксперименты показали. что в течение 3-4 ч в культуре ткани переднего гипоталамуса не наблюдается некротиче- 45 ских изменений, а эксплантаты обладают способностью синтезировать и выделять в среду белки. Значительно меньший выход белка в среду наблюдали при температуре инкубации 4 С. Можно думать, что гибели 50 самих нейронов не происходит. В среде, содержащей нормальное количество Са, возможно образование мембраноподобных поверхностей и эалечивание "культи." аксона (Lumsden, 1970; Moss-et ai., 1974; Obata, ББ

1974). Остается невыясненным механизм выделения белка в среду иэ эксплантатов, однако наличие ритмичности в этом процессе(Коваленко, 1981, Загустина, 1981; Грачев и др., 1981) позволяет допустить воэможность экзоцитоподобных процессов. В целом, несмотря на незавершенность исследования характеристик переживающей культуры фрагментов гипоталамуса, этот методический подход представляет определенйый интерес при изучении некоторых особенностей нейросекреторных образований. К достоинствам переживающей культуры фрагментов гипоталамуса можно отнести . а) отсутствие экстрагипотэламических влияний; б) возможность контроля за состоянием среды инкубации; в) точная дозировка физиологически активных веществ; г) возможность биохимического исследования эксппантатов и продукта, выделенного в среду; д) воэможность проведения различного рода морфологических, морфометрических и других работ, существенно дополняющих информацию о деятельности нейросекреторных образований.

Как показали наши исследования (Грачев, Скопичев, Пруцков, Коваленко, 1987), проведенные на фрагментах переднего гипоталамуса, происходит выход белка в среду инкубации, причем минимальное значение приходились на период с 30-й по 40-6 мин. опыта. Морфометрия нейросекреторных клеток и их ядер выявила синхронные изменения, выражающиеся в первичном набухании и последующем уменьшении объема клеток и ядер. Следует отметить, что выделение белка в среду несколько опережает изменение клеточного объема. . Содержание Д-ксилозы в клетках супраоптического ядра под непосредственным влиянием ацетилхолина снизилось на

28%, что свидетельствует о существенных изменениях мембранно-транспортных процессов (табл.3), Следовательно, можно говорить о четкой взаимозависимости процессов биосинтеза белка, трансмембранного транспорта сахаров.

Наряду с этим мы сопоставили изменения обьемов нейронов культуры клеток супраоптического ядра и уровень белкового синтеза. Используя в качестве меченого предшественника H-лейцин, мы смогли одновременно оценить интенсивность включения метки и размеры клеток. Сопо- стэвлейие данных авторадиографии и морфометрии позволяет отметить четкое еобтветствие изменений объемов клеток и количества гранул серебра над этими клетками, Реакция на ацетилхолин, приводящая к уменьшению объема клеток, сопровождается значительным уменьшением включения ЗН-лейцина. Оценивая результаты этого опыта, мы отметили высокую степень корреляции между изменением объема и интен1811843 культивируемой ткани с состоянием нейросекреторных образований интактного мозга. ческие изменения в нейросекреторных клетках.

Одним из наиболее широко применяемых

Результаты данного опыта позволяют показателей в большинстве исследований использовать для направленного воздейстактивацией всей цепи взаимосвязанных клеток оказались индивидуальные реакции процессов секреторного цикла. Действие 15 клеток, непосредственно связанные с особенностями метаболических процессов;

Результаты применения заявляемого проникающего через гемато-энцефалический барьер препарата приводит к изменениям вещества "дистагмина" показали, что для уровня ацемлхолина в супраоптическом ядре и реализации его тормозного действия, стимуляции нейросекреторных клеток можприводящего к уменьшению объема нейро- 20 но использовать действие ацетилхолина в секреторных клеток.:: . гипофизе, Влияние проникающего через ге-

Вывод йз примера 3. Действие заявляемато-энцефалический барьер препарата (прототипа) приводит к изменениям количемого вещества способно стимулировать ства ацетилхолина на уровне супраоптического ядра, в результате чего уменьшается объем нейросекреторных клеток. секрецией: атония матки и слабость родообразованиях гипоталамуса

Технико-экономическая эффектив- вой деятельности, гипогалактия, амнезия и ность. . . алкоголизм.

Формула изобретения.

Способ стимуляции нейросекреторных нейросекреторных клеток гипоталамуса, . клеток гипоталамуса в эксперименте путем позволило выявить и подробно описать введения антихолийостеразных препарацитофизиологические реакции нейросекре- тов, отличающийся тем, что, с целью

Таблица 1

Константы,"характеризующие кинетику взаимодействия заявляемого соединения и прототипа с ацетилхолинэстеразой

1 сивность включения метки при инкубации культуры без физиологических воздействий {r +0,98; P < 0,01) и при действии ацетилхолина (8 - = 0,96; Р < 0,01). Все это указывает на функционально-метаболи- 5 вия на нейросекреторные клетки в одном 10 случае негидролизуемый холинэстеразами ацетилхолин в гипофизе и стимулировать выделение секрета с последующей нейросекреторную активность нейронов супраоптического ядра, и близкого по архи- 25 тектонике паравентикулярного ядра, Повы-. шение продукции эндогенных нейропептидов (окситоцина и вызопрессина является необходимым для выполнения нарушенного секреторного процесса в нейросекреторных 30

Большое число функционально-морфо-. логичеСких исследований, проведенных на 35

1орных клеток при активации и подавлении секреторного процесса (Поленов, 1968, 40

1981). По данным авторадиографического анализа, включение меченых предшественников РНК, процесс интенсификации белковогЬ синтеза предваряетс усилением метаболизма нуклеиновых кислот (Голубицина, 1977). В нашем исследовании, проведенном в модельных условиях, нас интересовала сопоставимость клеточных реакций и морфометрических показателей является величина (объем) нейросекреторных клеток (Абдулходжаева и др., 1975; Степанова, 1987). Очень важными для анализа. деятельности нейросекреторных

Восстановление продукции нейропептидов: окситоцина и вазопрессина необходимо для лечения различных заболеваний, связанных с.недостаточной их повышения эффективности воздействия, вводят гексаметилен-бис311-метилкарбоминовой кислоты-2-2-диметиламинометил пиридинового эфира в дозе 1. 10з г на 1 кг массы тела, 10

1811843 г

Таблица 2

Средние летальные и токсические дозы заявляемого соединения и прототипа в опытах на животных разных видов при разных путях введения препаратов

Таблица 3,Содержание сахаров мг $ в ткани гипоталамуса (в опытах использованы гипоталамусы от 203 крыс) Примечание; в/ц — внутрицистернально, в/ж — внутрижелудочно "по нарушению рефлексов" — имеются ввиду безусловный рефлекс избегания удара током,