Способ консервирования гепатоцитов

 

Использование: биология, медицина, криобиология. Цель изобретения - повышение морфо-функциональной сохранности гепатоцитов. Сущность изобретения - гепатоциты инкубируют при 244°С с Ю-15%- ным диметилсульфоксидом в течение 10-15 мин. замораживают до (-20)-(28)0С, выдерживают при этой температуре 20-60 мин, затем погружают в жидкий азот и замораживают до -196°С. 3 табл.

СОК)3 COt3F. ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХ

РЕСПУЕкПИК (5!)5 А 61 К 47/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОГ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4870736/14 (22) 02.10,90 (46) 07.05,93. Бюл. N. 17 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) А.Ю.Петренко, В.П.Грищук, А.Д.Росляков и С. П, Мазур (56) Авторское свидетельство СССР

М 902695, кл. А 01 N 1/02, 1979. (54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕПАТОЦИТОВ

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для консервирования клеток, выделенных из тканей.

Цель изобретения — повышение морфофункциональной сохранности гепатоцитов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе консервирования гепатоцитов, включающем инкубацию суспензии клеток в среде, содержащей диметилсульфоксид, с последующим ступенчатым охлаждением до температуры жидкого азота, в среду суспендирования добавляют CaClz, охлаждение проводят в два этапа; на первом этапе суспензию клеток охлаждают до (-20)+28) С и выдерживают 20-60 мин, а затем помещают в жидкий азот.

Способ иллюстрируется. следующими примерами.

Пример 1, Для выделения гепатоцитов вскрывали брюшную полость анестезированных животных массой 200-300 г, вводили канюлю в воротную вену, надсекали нижнюю полую вену и перфузировали

„, SU„„181345l А1 (57) Использование; биология, медицина, криобиология, Цель изобретения — повышение марфо-функциональной сохранности гепатоцитов. Сущность изобретения — гепатоциты ин куби руют и ри 244 С с 10-15 ным диметилсульфоксидом в течение 10-15 мин. замораживают до (-20)-(28) С, выдерживают при этой температуре 20-60 мин, затем погружают в жидкий азот и замораживают до -196ОС, 3 табл. печень со скоростью 25-35 мл/мин при 37 С раствором, содержащим 0,25 M сахароэу, 5 мМ КС1, 0,4 мМ КНрР04, 1,6 мМ йаНР04, 0,8 мМ М9С!2, 50 мМ трис-HCI, 4 мМ ЭДТА, рН

7,4. После окончания песфузии печень извлекали иэ брюшной полости, измельчали и подвергали дезагрегации с помощью вибрационного устройства в среде перфузии, где в

ЗДТА заменяли на 2 мМ СаОр. Полученную (р суспенэию фильтровали через нейлоновый фильтр, Жизнеспособные клетки отделяли путем дифференциального центрифугирования и суспендировали в среде. дезагрега-: ции. Гепатоциты, суспендировали в среде, О содержащей 250 мМ сахароэы, 5 мМ КС1, 0,4 мМ КН2Р04, 1,6 MM NaHP04, 0,8 MM М9С12, 50 MM трис-HCI,2 MM CaClz(pH 74), иикубировали при 2 — 4 С с 10 -ным ДМСО, приготовленным на этой же среде, в течение 10 мин. Консервирование гепатоцитов осуществляли по следующей программе: на первом этапе охлаждали от 2 до -25 С путем погружения контейнеров с суспензией клеток в жидкость, предварительно охлажденную до

-25 С, и выдерживали при этой температуре

1813451

Табл ица1

П едеегеемы

85,3+ 1

8,8 + 0

Показатели

1,25+ 0

1,80+ 0

30 мин, На втором этапе охлаждали до196 С, погружая контейнеры в жидкий азот, Морфологический анализ суспензии гепатоцитов проводили методом окрашивания 0,2%-ным раствором трипанового синего. Дыхательную активность определяли полярографически. Детоксикационную активность определяли по образованию рнитрофенола при инкубации гепатоцитов при 35ОС с р-нитроанизолом, В табл. 1 представлены морфофункциональные характеристики гепатоцитов, консервированных предлагаемым способом и способом прототипом.

Результаты, приведенные в табл, 1, показывают, что использование данного способа позволяет получить консервированные гепатоциты, дыхательная активность которых в 2 раза меньше по сравнению с прототипом, Эффективность окислительного фосфорилирования митохондрий в составе клетки также лучше сохраняется при использовании этого способа. Особенно резкие различия между способами были выявлены при определении коэффициента стимуляции дыхания сукцинатом, который характеризует целостность плазматической мембраны клеток (сукцинат слабо проникает через интактную плазматическую мембрану), Клетки, консервированные предлагаемым способом, способны осуществлять детоксикацию ксенобиотиков, что позволяет использовать их для лечения печеночной недостаточности.

Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, только изменяли конечную температуру охлаждения на первом этапе, Из табл. 2 видно, что оптимальной температурой остановки на первом этапе охлаждения является (-20)-(-28) С, При снижении температуры сохранность изолированных геИсключение трипанового синего, %

Скорость эндогенного дыхания, нмоль Ог мин/мг белка

Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом

Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания разобщителем патоцитов снижается почти на 30%, а при повышении — на 38%.

Пример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, только изменяли время температурной остановки.

Из табл. 3 видно, что оптимальным временем остановки на первом этапе охлаждения является 20-60 мин, При уменьшении и увеличении времени остановки сохранность изолированных гепатоцитов снижается на

25-30 .

Преимущества способа, 1. Способ обеспечивает высокую морфо-функциональную сохранность гепатоци"5 тов: скорость эндогенного дыхания в 2 раза выше, чем по прототипу, в степень с"гимуляции дыхания сукцинатом, как показатель интактности плазматической мембраны, в 3 раза ниже, Сохранение детоксикационной

20 функции консервированных гепатоцитов позволяет использовать их как для изучения механизмов биотрансформации ксенобиотиков, так и для лечения печеночной недостаточности.

2. Способ проще прототипа, поскольку предусматривает двухэтапное охлаждение образца.

Формула изобретения

30 Способ консервирования гепатоцитов, включающий инкубацию суспензии клеток в среде, содержащей диметилсульфоксид, с последующим ступенчатым охлаждением до температуры жидкого азота, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения морфо-функциональной сохранности гепатоцитов, в среду суспендирования добавля ют хлористый кальций, охлаждение проводят в два этапа, при этом на первом этапе сусч0 пензию клеток охлаждают до ("20)-(-28) С и выдерживают в течение 20-60 мин, а затем помещают в,.жидкий азот, 1813451

Продолжение табл. 1

Способ-прототип

Показатели

Детоксикационная активность, нмоль р-нитрофенола/

30 мин.мг белка

12,0+ 0,6

Не on е еляли

Таблица2 и-5

Показатель

Темпе а а охла ения

53»- 7

Таблица3

n=5

Время остановки, мин

Показатель

80

20

18»- 4 65»-7

85»- 8

86» 6

82»- 9 61»- 7

84 + 5

Составитель А,Петренко

Техред М,Моргентал Корректор Т.Вашкович

Редактор

Заказ 1796 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Исключение трипанового синего, Исключение трипанового синего, -1s С

47+ 4

-20ОC -25 С

85 » 5 85 + 8

-28 С -35ОC

77+ +8. 60» 7

- 196ОС

17 »- 7