Способ получения инактивированной гриппозной вакцины

 

Использование: в медицинской промышленности и касается производства вирусных препаратов. Сущность изобретения: для заражения каждого куриного эмбриона используют смесь вирусов гриппа, содержащую по 0,1 мл обоих штаммов с инфекционной активностью 3,0-3,5 Ig ЭИДю 0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже 1:512. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я3 „„1822791 А1 (я)э А 61 К 39/145

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К . АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4910106/13 (22) 11,02.91 (46) 23.06.93. Бюл. f+ 23 (71) Ленинградский научно-исследователь- ский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера и Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа (72) Е.А.Брянцева, Ф.И.Полежаев, М.А.Бичурина, H P.Ðîçàåâà и Н.И,Чубарова (56) 1. ТУ 42,14.149-78 на вакцину гриппозную хроматографическую инактивированную.

2. Фармакопейная статья 42-249 ВС-89 на вакцину гриппозную хромотографическую инактивированную жидкую для детей типа А.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства вирусных вакцин, в частности инактивированной гриппозной вакцины.

Целью изобретения является получение двукратной экономии основного биологического сырья (куриных эмбрионов) и трудозатрат, связанных с его обработкой (в частности технологические операции по транспортировке, заражению, 72-часовой инкубации при +34 С, охлаждению, сбору вируссодержащей жидкости, очистке от посторонних примесей, концентрированию вирусной суспенэии, инактивации вируса, сохранению полуфабриката, утилизации отработанного сырья) при производстве инактивированной гриппозной вакцины.

Поставленная цель достигается тем, что вдвое меньше по сравнению с ранее требо3. Регламент производства hk 173-89 на вакцину гриппозную хроматографическую инактивированную жидкую для детей. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ (57) Использование: в медицинской промышленности и касается производства вирусных препаратов. Сущность изобретения: для заражения каждого куриного эмбриона используют смесь вирусов гриппа, содержащую Ilo 0,1 мл обоих штаммов с инфекционной активностью 3,0-3,5 Ig ЭИДБо 0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже

1:512. 4 табл. вавшимся количеством 10-дневных куриных эмбрионов заражают смесь двух вакцинных высокорепродуктивных штаммов, взятых в" дозе 3,0-3,5 Ig ЭИДБ0/0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже 1:512; используют вакцинные штаммы не зависимо 4 от их происхождения — родительский виру- Q сов, применявшихся для их получения (см. в примеры 1 и 2), После 72 ч инкубации при

34 С в течение 12-24 ч отбирают вируссодержащую аллантоисную жидкость. Последнюю подвергают очистке от посторонних примесей, концентрированию и инактивации. В полученную вирусную суспенэию добавляют стабилизатор и фасуют в стеклянные флаконы различной емкости или ампулы.

Заявленное предложение, суть которогсгзаключается в получении "двойного" уро1822791 жая вакцинных штаммов, на одной партии куриных эмбрионов позволяет экономить не только половину ценного питательного продукта, каковыми являются куриные яйца, но и сократить на половину трудозатраты, связанные с их переработкой по всему технологическому циклу при сохранении гемагглютинирующей, иммуногенной активности и чистоты конечного продукта (вакци чы).

Пример 1. Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа

А/Тайвань/1/86(H1N1) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86) и

А/Миссисипи/85(HÇN2) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Миссисипи/1/85), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3,5 lg

ЭИД о. Инкубируют при 34 С в течение 72 ч. Зараженные куриные эмбрионы охлаждают при +4 С в течение 12-24 ч, вскрывают и собирают вируссодержащую аллантоисную жидкость с гемагглютинирующей активностью 1:512/0,2 мл.

Концентрирование и очистку вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) от посторонних примесей осуществляют следующим образом: ВАЖ фильтруют на модуле ФТ (НПО АН СССР) через два слоя картонного фильтра (ТУ 13-7303001-686-84) и через 1 слой полимерного фильтра МФАМА (Владипор) с диаметром пор 0,8 мкм при давлении 1,2 атм. Контроль фильтрованной

ВАЖ проводят в реакции торможения гемагглютинации (РГА) с 17-ной суспензией куриных эритроцитов. Концентрирование

ВАЖ проводят на ультрафильтрационной установке УПЛ-06 на полых волокнах ВПУ15 ПА.

Гельфильтрационную очистку концентрата ВАЖ проводят на силикатном сорбенте — макропористом стекле МПС (2000 "В

Горьковского опытного завода при ВНИИ

Hll), модифицированном поливинилпирролидоном в колонке 5 х 80 см. Элюцию проводят 0,02 М фосфатным буферным раствором (ФБР) рН-7,2-7,4+0,15 М NaCI.

После прохождения через сорбент собирают фракции по 20 мл, определяют в них гемагглютинирующую активность, содержание белка и овальбумина. Обьединенный вирусный материал инактивируют УФ-лучами в течение 3 мин в статистических условиях и проверяют полноту инактивации путем заражения куриных эмбрионов (2 пассажа).

Гемагглютинирующую активность определяют в реакции гемагглютинации с 1 ными куриными эритроцитами. Содержание белка определяют по методу Лаури с предварительным осаждением белка 20 -ной трихлоруксусной кислотой. Содержание овальбумина определяют в реакции непрямой гемагглютинации с комерческим препаратом. Определение количественного содержания гемагглютинина в препарате осуществляют методом радиальной иммундиффузии (РИД) по Schild у (4).

10 Безвредность препарата оценивают на белых беспородных мышах и морских свинках в соответствии с приказом МЗ СССР hk

31 от 13.01.83 г. Иммуногенную активность проверяют на беспородных мышах весом

15 14-16 г. Животным вводят внутрибрюшинно однократно и двукратно с интервалом в 14 дн по 0,3 и 0,6 мл препарата. Кровь берут на

10-14 сут после последней иммунизации, сыворотки проверяют в реакции торможе20 ния немагглютинации (РТГА) с гомологичным штаммом вируса гриппа. Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о достаточно высокой иммуногенности полученного препарата как в отношении штам25 ма гриппа А/Тайвань/1/86 (H1N1), так и

А/Миссисипи/1/85(HÇN2), как при однократном, так и при двукратном введении.

Далее полученный вакцинный препарат испытывают в опыте перекрестной за30 щиты иммунных животных по методу (5). С этой целью готовят иммунную группу животных; белых мышей весом 12-14 г иммуниэируют дивакциной внутрибрюшинно в объеме 0.3 мл однократно и двукратно с

35 интервалом в 21 день, Через 21 день после последней иммунизации мышей делят на 4 группы, 2 из которых иммунизированы однократно и 2 иммуниэированы двукратно, и заражают интранаэально под легким эфир40 ным наркозом свежими аллантоисными культурами гомологичных штаммов вирусе гриппа: А/Тайвань/1/86(Н1й1) и А/Миссисипи/1/85(HÇN2). Кроме иммунных живо THblx используют две контрольные группы

45 мышей, предварительно не иммунизированных. Вирусу используют в разведениях от 10 до 10, применяя по 4 мыши нв каждое разведение вируса. Через 72 ч после заражения мышей обескровливают путем

50 забора крови из веноэного синуса у медиального угла глаза, вскрывают, извлекают легкие, растирают в ступке с песком и готовят легочную суспензию. Суспензией легких каждой мыши заражают по 4 эмбриона, ин55 кубируют 72 ч при Т -34 С. После охлаждения эмбрионов в течение 12-24 ч при+4 их вскрывают и регистрируют репродукцию вируса с помощью реакции гемагглютинации. Степень защиты оценивают по разнице репродукции вирусов контрольных и опыт1822791

55 ных групп, используя расчет по Керберу (6).

Данные эксперимента, представленные в табл. 2, свидетельствуют о высокой степени защищенности мышей, иммунизированных как однократно, так и двукратно. В отношении штаммов вируса гриппа А/Тайвань/1/86(H1N1) защита составила соответственно 3,75 Ig ИДю и 5,25 Ig ИДю, А/Миссисипи/1/85(H3N2) — 3,75 Ig ИДю.

Такимобраэом, присовместном культивировании двух штаммов вируса гриппа:

А/Тайвань/1/86(H1N1) и А/Миссисипи/1/85(H3N2), получают вакцинный препарат, соответствующий требованиям ТУ

42.14,149-78. Параметры полученного препарата в сравнении с прототипом представлены в табл. 4, Пример 2, Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных lUTBMMQB вируса гриппа:

А/Тайвань/1/86(h1N1) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус

А/Тайвань/1/86) и P — 1 (H3N2) (донор репродуктивности А/Ленинград/9/46 х дикий вирус А/Ленинград/16/88), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 3 Ig

ЭИД5о. Инкубируют при То — 34 С в течение

72 ч. Затем зараженные куриные эмбрионы охлаждают при T + 4 С в течение 12-24 ч, вскрывают, собирают вируссодержащую аллантоисную жидкость с гемагглютинирующей активностью 1;512. Да ее проводят очистку, концентрирование, элюцию по методу, описанному а примере 1. Определение общего белка, овальбумина и весового количества гемагглютинина проводят аналогично описанному в примере 1 результаты по иммуногенной активности свидетельствуют от ее достаточности (средняя геометрическая титров антител в отношении штамма вируса гриппа

А/Тайвань/1/86(Н1М1) при однократной иммунизации составила 1:147, а В Отношении штамма вируса гриппа P-1(H3N2) составила 1:169, при двукратной иммунизации—

1;447 по отношению к обоим штаммам вируса гриппа). Далее проводят испытания препарата в опыте перекрестной защиты иммунных животных. Оранжировка опыта аналогична описанной в примере 1.

Результаты опыта представлены в табл.

3 и свидетельствуют о высокой степени защищенности мышей в отношении гомологичных штаммов вируса гриппа. Так, степень защиты к вирусу гриппа А/Тайвань/1/86(H1N1) при однократной и двукратной иммунизации составила соответственно 3.0 и 5,0 Ig ИД о, а к вирусу

P-1 (НЗИ2) — 1.75 и 2,75 Ig ИДю

Как и в примере 1, полученная дипахцина (табл, 4) отвечала требованиям технической документации, но для ее приготовления было истрачено вдвое меньше эмбрионов, чем при раздельном культивировании вирусов.

Пример 3. Проводят совместное культивирование на куриных эмбрионах двух вакцинных штаммов вируса гриппа:

A/Òàéâàíü/1/86(H1N1) (донор репродуктивности А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус

А/Тайвань/1/86) и Р-1 (K3N2) (донор репродуктивности А/Ленинград/9/46 х дикий вирус А/Ленинград/16/88), взятых в равных объемах и дозах, соответствующих 2,0 Ig

ЭИД5о и 4,0 Ig ЭИД5о с гемагглютинирующим титром 1:512. Весь дальнейший процесс: инкубация, сбора вируссодержащей аллантоисной жидкости, технологии, проводили по метоцу, описанному в примере 1.

Полученный вакцинный препарат по гемагглютинирующей активности отвечал требованиям, предьявленным к инактивированным гриппозным вакцинам

ИГВ), гемагглютинирующий титр равнялся

1:1024 в 0,2 мл. При определении весового количества немагглютинина в РИД с моноспецифическими сыворотками к штаммам вирус» гри па Л{Н IN!) . A(H3N?) Выявлено наличие гомагглю ив. ьна А(>ЗЫ2) В количестве 30 мк/мл, гемагглютинина A(H1N1) не обнару>хено, Была констатирована иммуногеннsя ахfèвность н» мышзх к вирусу гриппа А(НЗИ2)- 1:150., з к вирусу A(H1N1) находи : сь на уг Овне кнгибиторов.

Таким о9разом, при совместном культивировал: и,ы,у . штампов гриппа A(H1N1) и

А(НЗ"й), различающихся между собой по инфекц онной активности 8 2 lg ЭИД5о, не приво; .;; к адекватному наклонению биомассь обоих н таммов Вируса гриппа, т.Е. страд «т репродукция Вируса, Взятого В до" зе, мел шей 3 Ig ЭИД..о.

П р л м е р 4. Проводят совместное кульгивирование двух вакцинных штаммов вируса гриппа А/Тайвань/1/86(Н 1 N1) (донор непродуктивности Л/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Тайвань/1/86) и Л/Миссисипи/1/85(H3N2) (донор реп родуктивности

А/Пуэрто Рико/8/34 х дикий вирус А/Миссисипи/1/85), взятых в равных обьемах и дозах, соответствующих 3 Ig ЭИД5о, и с равными исходными гемагглютинирующими титрами: А/Тайвань/1/86(Н1И1) — 1/512, А/Миссисипи/" /85/(H3N2) — 1/128, Полученный вакцинный препарат по гемагглютинирующей активности отвечает требованиям, предьявленным к ИГВ—

1:1024 В 0,2 мл.

1822791

Т ° блица 1

Нннуноганность диеекцмни, приготовленной иа смрьа, полуменного прм соанестюм культнвмрованми двух памюв вируса гриппа:

A (Тайвань) 1/86 (НIН1) + А(Ннссисипи)1/85(НЗИ2) Препарат скал титров антител ° нев вируса грнтпа

И1) А(Ниссмснпм)1/85(НЗН2) нне величине) Дмвакцмна

А(Тамвань)

I/Â6(HIH1)+

А(Ниссисмпи)1/85 (H3M2) Ьнутрибровннно 0,3 одюкратю

0,Ь

147

1 12

169

256

Ьнутрм01ивамнно двукратно 0,3

958

Т а бг и ц а 2

Раауп ° òàòv oflVTOI равитц юювей, нмнунианроеан 4ьх днеакцимой, сострадай ма атаманов вируса грьеюв: Я(Тайвань) 1/86(1НИ! ) w А(Ниссисипи) 1/85(НЗИ2) Препарат ность t Уровень рапроду амир авраменки Втамаа ь аавмти а 10 НД

А(Тайвань)1/86 (Н!И1) ань) 1/8Ь А(лисснснпи)

1/85 (Н)Н2) Диеакцииа А(Тай° а» )1/86(Н1И!)

+ А(миссисипи) I/85 (Н)Н2) 4,0

3. 25 одюкратнел

3,75

2,0

3,0

6,75

> 5,25

3,75 де укра т на л

Нат препарата

7.25

При определении весового количества гемагглютинина в РИД выявлено: концентрация гемагглютинина А(Н1М1) равнялась

26 мкг/мл, что соответствует требованиям, а к гемагглютинину А(НЗМ2) - 10 мкг/мл, что не соответствует требованиям, предъявленным к вакцинным препаратам по этому параметру. Иммуногенная активность по отношению к штамму вируса гриппа A(H1N1) составила 1/80, а к A(H3N2) — 1/40, что не соответствует требованйям к препарату по этому параметру (необходимо 1/80).

Таким образом, совместное культивирование двух штаммов вируса гриппа

А(Н1й1) и A(H3N2), различающихся по гемагглютинирующей активности, приводит к неравномерному накоплению компонентов, что отрицательно сказывается на качестве препарата.

Учитывая вышеизложенное, оптимальным является совместное культивирование двух штаммов вируса гриппа с инъекционной активностью 3,0-3,5 Ig ЭИД5о и при гемагглютинирующем титре не ниже 1/512.

Таким образом, при совместном культивировании двух вакцинных штаммов вируса гриппа A(H1Nl) и A(H3N2), взятых в равных обьемах и дозах, соответствующих 3,0-3,5 Ig

5 ЭИД о, при равном титре гемагглютинина не ниже 1:512, имела место двукратная экономия куриных эмбрионов, а также значительное упрощение и сокращение сроков технологического процесса. Это заключа10 лось в следующем: в два раза сокращались объемы сырья, необходимого для очистки и концентрации вируса, уменьшились затраты на транспортировку, хранение, утилизацию отходов и другое.

15 Формула изобретения

Способ получения инактивированной гриппозной вакцины, включающий накопление вирусной биомассы путем инокуляции куриных эмбрионов штаммами вируса грип20 па, отличающийся тем, что используют для заражения каждого куриного эмбриона смесь суспенэии двух штаммов вирусов одновременно, содержащую по 0,1 мл каждого с инфекционной активностью 3,0-3,5 Ig

25 ЭИД5о/0,2 мл при равном титре гемагглютининов не ниже 1:512.

1822791

Табпмца3

Результаты опыта защиты 0ВН2вй, мнмунмвмрраам0ВОХ дмзакЦмнсй, СОСтолщвй ма етаннэв вмруса грнппа2 А(Тайвань)1/86(ИIИI) + Р-1 й(Ленинград)16/88) (ИЗ::2) Уровень рвпродукцмм емруса посла заоакенмл втаннанн ° 10 НД

Препарат

Кратность

° ввдвммл нь защиты в 10 ИД

А (Тайвань) 1/86 (ИIИ1) P-1(ИЗИ2) ° амь) 1286 Р-1 (ИЗН2)

Нl ) одно коа т нам 2,75

3,0

1, 75

0,75

5, 75

5,0

2,75 двукратнан

Нет препарата

Гаfëмцв4

Результаты комропн мскодюго аЛлантонсного с02рьп н и0.22esoro продукта в сраенсмкн j прототипом

Комролмруеьв0в показателм

Свротнп вм- Исмзднзе сырье руса грн2па

0 2 ) 0 2

Опыт 2 ) Прототип

Прототип

1024

2048 I 024

1024

512

Гемагглетмммрутззал

° ктмемость ГЕ/0,2 нл

512

8,0

9,0

16,0

16,3

26,0

30,0

10,0

10,0

Весовое колмчестео гвнагглетмннна,нкт/нп

Объем, нл

440,0

1000,0

3000 ° 0

210,0

1800,0

Нонцентрацнв o0Aего белка, нкг/нл о

1600 ° 0 1680,0

140,0

150,0 150,0

Нонцентрацмл ое4ц0 °бунина, нкг/001l

180, 0

2,0

200,0

220, О

0,5

1: 147

1290

Средмнй геонетр0в0ес0ов1 тнтр ° íòìòàë ° кроен

waeA к ГА

A (Hl H 1 ) 1, 147

А (НЗИ2 )

А(ИIИ! )

А (ИЗН2) 1: 112

42,0

38,0

1ь169

38, 1

44,0

1: 110

37,4

37. 6

Эымод целевого продукта ло мкг/нл ГА),t

Степень очнсткн по белку, \

80,0

95,7

95,6

99,88 99,78

Степень оммсткн по оа S >,ã

99,87

A(HINl)+

А(НЗИ2) ° ыкод целевого продукта, г (дмеакцмна) 81,2

80,0

37,5

Составитель

Техред M,Ìîðãåíòàë

Корректор О.Густи

Редактор

Заказ 2169 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Ямаакцмна

А(Тайвань)

1/86(И1Н1)

+Р I(HÇH2) A (HI Ill ) ((ИЗН2)

А(НIИ1)

А(НЗИ2)

А(ИIНI)

А(НЗИ2) 1,5

0,5

3,25

5i 2

512

8,0

9,0

1000,0

1000,0

15,0

l7,0

200,0

200, 0