Способ размножения вирусов гриппа
Использование: вирусология, иммунология . Сущность изобретения: систему для размножения вируса (куриные эмбрионы, культуры клеток куриных фибробластов или взвесь свежетрипсинизированных клеток почек хомяка) обрабатывают электромагнитными полями: постоянным с напряженностью 100-5000 Э в течение 5-40 мин или переменным с напряженностью 1000-5000 Э в течение 10-35 мин с периодом колебаний 50-60 с. Обработку проводят до заражения вирусом. Титры вирусов гриппа увеличиваются на 1,03-4,8 логарифма ЭМДбо. 2 з.п.ф-лы, 1 ил., 8 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИКГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТННП1ОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР )
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
1 (21) 4889746! 13 (22) 10.12.90 (46) 23,12.92. Бюл, N. 47 (71) Уфимский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им, И.И.Мечникова (72) Г.Н.Поезжалова и P.À.Äoðîøåíêo (56) Регламент производства вакцины гриппозной, химической, адсорбированной жидкой. Утв. 26 мая l987 r, Уфимский НИИВС.
Гогбаидзе Г.А., Курашвили В.Е. Влияние переменного низкочастотного магнитного поля на репродукцию некоторых вирусов и процесс интерфероноабразования. Тезисы докл. ХИ съезда микробиологов и эпидемиологов. М.: l979, ч.3, с.35.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к вирусологии, и может. быть использована в практической работе со штаммами вирусов гриппа для получения высокопродуктивных вариантов.
Цель изобретения — повышение титров вирусов гриппа.
: . Предложенный способ заключается в том, что на 10-11 дневные куриные эмбрионы, культуры кле гак или свежетрипсинизираванные взвеси клеток почек сирийского хомяка воздействуют постоянным электромагнитным полем (пост. ЭМП) в дозах 1005000 Э в течение 5 40 мин или колеблющимся электромагнитным полем
ЭМП 1000-5000 Э в течение 10-35 минут с периодом колебаний 50-60 с. Затем производят заражение куриных эмбрионов или вырОсших культур клеток одним из штаммав вирусов гриппа, инкубируют их в термаста) Ы 178299ОА1 (й)з С 12 и 7/00, А 61 К 39/145
2 (54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЙ ВИРУСОВ
ГРИППА (57) Использование: вирусолагия; иммунология, Сущность изобретения: систему для размножения вируса (куриные эмбрионы, культуры клеток куриных фибробластов или взвесь свежетрипсинизированных клеток почек хомяка) обрабатывают электромагнитными полями; постоянйым с напряженнасть1о 100-5000 3 в течение 5-40 мин или переменным с напряженйостьа 1000-5000
Э в течение 10-35 мин с периодом колебаний 50-60 с. Обработку проводятдо заражения вирусом. Титры вирусов гриппа увеличиваются на 1,03-4,8 логарифма
ЭИД5р, 2 э.п.ф-лы, 1 ил., 8 табл, % те при температуре (35 и 1)0С и собирают вируссодер>кащую жидкость известными способами, В ней определяют гемагглютиеаее и нирующие и инфекционные титры. Предло- " 4 женный способ осуществляют в следующих (O вариантах, В а р» а н т 1. Воздействие на куриные эмбрионы постоянного электромагнитного паля (пост.ЭМП) разной напряжениости, О
Куриные эмбрионы(КЭ) помещаютмежду полюсами электромагнита в вертикальном положении тупым концом вверх на,Ф» какой-нибудь подставке, например из пено- пласта или полиуретана. Воздействие ЭМП осуществляют в течение 5-30 мин. В качестве контроля служат КЭ, помещенные за пределами воздействия поля. Затем производят их заражение вирусом.
После заражения "амагниченные" и контрольные эмбрионы инкубируют извест10
30
35 ным cnocoGoM и отсасывают аллантоисную жидкость.
П р и и о р 1, Пост, ЭМП напряженноСтью 100-5000 Э. Время обработки 5 мин.
Вйрусный штамм-рекамбинант Х 53-А (Н свиной, Ь 1). Обработку полем проводят спа обам, оп. 1санным выше, после чего эара>t Гемагглютинирующие титры onðåäåëaны в рeat Средние данйые титров рекамбинантнага вируса Х 53-А после "оматничицанил" куриях эм>брионов-пост, ЭМП разной taпряЖенкбсти представлены в табл,1, Как вйдна из табл 1, достйгнуто увеличение"титров вируса при всех значениях поля,с Максимумам н до "àõ 4500 — 5000 Э. Пример 2, В опыте используют низк. апродуктивный штамм А/Виктория/36/72, применяя паст,ЭМП 1000 Э при различном врем ни воздействия. Эти даннйе приведены н табл.2. Как видно из табл.2, наблюдается унеличенив тИтров вируса гриппа А/Виктория прги. обработке в течение 10-30 мин, .Пример 3, Опыт проводят аналогично примеру "2, используя рекомбинантный Йта ммevpyca гриппа Х-53-А(Н свиной, М..1}, Результаты приведены в табл.3, В данной примере наибольший эффект гголучен при воздействий постоянного магЙЙтйОга паля на куриные эмбрионы в течвййе 5 мин. При определении инфекционных титров поставлена разнерйутал реакция гемаггл1отинации . с вируссадержащим йатеоиалом каждого эмбриона. Результаты Йрйнедены а табл,4. Из табл.4 видно увелйчейиб гемагглютйниру1ощих титров в алантоисной ч<идкоСти амагниченных эмбрионон. Таким образоМ, йри экспозиций куриных эмбрионов в постоянном электоамагнитнам поле йа первом пйссаже достигнуто унелй енйе — тйтров в предельных разведения>< на втором пасса>ке. Иэ прйнеденных примеров можно сдел а1 ь еле ду1ощие выводы, Й ь держиванив кури f6l>< эмбриаЙав в постояHHOM элейграмагнитнай пале в течение 5-30 мин в дозе 100 — 5000 Э повалило увелйчйть ти грь -изученных штаммов вирусов гриппа, Время зкспозици>и и напряженность полл,90г д<ости женил Максимального эффекта. были различными в работе с раэньв;и штаммaми Так, у рекамбинанта X-53-А кратность йрироста ГЕ-титров была н 2-6 раза, инфекционных на l,5-3,1 логарифма ЭИД д nptn экспозиции в поле 5 — 10 мин с максимумом эффекта в 1000-5000 Э (см. табл. 1, 3). У ниэкопродуктинного штамма H2N2 (А/Виктория/72) ГЕ-титры увеличивались в 2 раза, инфекционная активность на 1-2,0 логарифма. В опытах были использованы также штаммы А/Техас/77 (НЗЙ2), А/Киев (H1N1), получены аналогичные результаты.. Бремя от обработки куриных эмбрионов до «х заражения не влияла на титры вируса, Как правило, эффект "омагничинания" сохранялсл длительное время. Следует отметить, что сильные поля 7000 и 10000 Э не приводили к дальнейшему увеличению титров вируса. В этом нарианте достигнуто также увелИчение титров изученных штаммов н "предельных разведениях" (10 -10 ) (см. табл.4), Б а р и а it т2. Воздействие постоянного электромагнитного поля на культуру клеток куриных фибропластов. Пример 4. На монослой выросшей . культуры клеток куриных фибропластон (КФ) ноэдейству1от постоянным электромаги итным полем н дозе 1000 Э в течение 5, 10, 15 и 30 мин. Пробирки cк:ультурой подвешивают между полюсами магнита или укрепляют на подставке. После опыта питательную среду сливают, клетки отмывают от следов сыворотки и производят заражение вирусным штаммом А/Ленинград/0139 (H2N2) с множественностью зара>кения 0,1 ЗИцва на клетку. Через 1 ч адсорбции вируса его слинают и вносят среду репродукции, например 199, Контролем служат пробирки с культурой клеток, зараженные вирусом, помещенные за пределами воздействия палл, Зараженные клетки культйнируют в термастате при температуре 35"C, äåëàë сборы нируссодержащей жидкости (B>K) через каждые 2-3 дня. На 5-й день меняют среду репродукции. В ВЖ определягот гемагглютинирующие титры с %-най нзвесью зритрацитов кур и инфекционные — заражением куриным эмбрионов. Результаты приведены в табл,5, l(at< видно иэ табл,5; достигнута увеличен пе титров вируса А/Левинград/0139 в культуре клеток КФ, выдеожанной в постоянном электромагнитном поле 10-30 мин. В а р и а н т 3, Воздействйе колеблющегася электромагнитного палл (колеб.ЭМП) на свежетрипсинизированные клетки почек 1782990 Пример 6. Проводят обработку взвеси ля клеток ПСХ колеблющимся электромагнит- 50 ным полем с последующим культивировани- ув ем двумя разными способами — м стационарным(в матрасах) и в вращающих- ту ся сосудах (роллерным). Для заражения бо культур клеток используют штамм вируса 55 ст А/Киев/5979 (H1N1). Множественность за- эм ражения 0,05 ЭИДьо/клетку. нь После экспозиции взвеси клеток, их ро разделяют на две порции. Одну вносят в (а сирийского хомяка (ПСХ) в дозах 1000-4000 Э с периодом колебаний 50-60 с, в течение 10 — 35 мин. Пример 5, Колеблющееся электромагнитное поле 1000 Э, Время обработки 10 и 15 мин. Свежетрипсинизированные клетки 5 ПСХ распределены по пробиркам в количестве 6 мл и подвешены в свободном состоянии между полюсами стационарного электромагнита. Контролем служат пробирки с клетками за пределами воздействия 10 поля, Затем клетки суспендированы с питательной среде Игла с 10ь сыворотки и распределены по ростовым сосудам. Выращивание стационарным способом. Клетки культивируют в термостате до обра- 15 зования монослоя, после чего заражают вирусом гриппа описанным ранее способом (см.с.1). В данном. примере использованы штаммы А/Ленинград/0139 (H2N2) и А/Техас/77 (H3N2). Множественность зараже- 20 ния 0,005 ЭИДю на клетку. Сборы ВКЖ сделаны на 3,4-е сут и на 3-е сут после смены среды (второй урожай вируса). В матрасиках с клетками, обработанными магнитным полем, на сутки раньше появились признаки 25 интенсивной репродукции вируса, проявляющееся в специфическом ЦПД, На чертеже представлена графическая характеристика электромагнитного колеблющегося поля, используемого в данном ва- 30 рианте (период колебаний 50 с). Как видно из чертежа, напряженность поля возрастала с 0 до 1000 Э в течение 25 с и снижалась до 0 в последующие 25 с, что усиливало биологическое действие его на 35 клетки. В табл.6 части "А" приведены средние величины титров вируса А/Ленинград/385/80, в части "Б" табл.6 — титры вируса А/Техас/77 в культуральной жидкости 40 клеток почек хомяка, Из таблицы 6 отчетливо видно увеличение титров обеих вирусов по гемагглютинации в 1,3-2,6 раза в первом урожае и в 8-16 раз во втором. Инфекционные титры при этом увеличились на 0,7-2,2 45 логарифма ЭИДцо и на 1,25-3 логарифма соответственно во втором, стеклянные матрасы и культивируют стационарным способом. Вторую помещают в роллерные сосуды и культивируют на аппарате "Ролласелл" (США) со скоростью 0,5 об/мин, После образования монослоя их заражарт вирусом по обычной схеме. Посевная доза в роллере— 1 млн.клеток/мл (см. табл.7). Таким образом, обработка колеблющимся электромагнитным полем свежетрипсинизированных клеток почек хомяка позволила повысить титры изученных штаммов. Положительный эффект оказался наиболее выраженным в работе с виру лми А/Ленинград/0139 (Н2М2) (табл.6). В а р и а н т IV. Использование колеблющегося электромагнитного поля для обработки куриных эмбрионов с последующим заражением их вирусами гриппа, Пример 7. Проводят обработку 10 — 11 дневных КЭ колеб,ЭМП 5000 Э с графической характеристикой, указанной на чертеже. Затем по обычной схеме их заражают вирусом гриппа А/Техас/77 (H3N2). Время обработки полем 10, 20 и 30 мин. Результаты титрования приведены в таблице 8. Как видно из табл.8, достигнуто увеличение титров вируса А/Техас/77 после экспозиции куриных эмбрионов в колеб.ЭМП 5000 Э. Следовательно, поставленная цель достигнута — увеличены титры (и соответственно репродукция) изученных штаммов вирусов гриппа, при использовании электромагнитных полей найденных характеристик: постоянного и колеблющегося — на разных биологических системах, источниках репродукции — куриных эмбрионах и первичных культурах клеток. Следует отметить, что разные штаммы размножались в "омагниченных" системах с неодинаковой интенсивностью. Для достижения максимального положительного эффекта необходим подбор параметров опытным путем. Метод прост и для достижения данного способа могут быть использованы любые стационарные электромагниты, позволяющие получить в зазоре между полюсами понапряженностью до 10000 Э. Применение данного способа позволит еличить титры вирусов гриппа при рэзножении их в куриных эмбрионах или кульрах клеток, получать варианты штаммов с лее высокой продуцирующей активноью, а также экономить расход куриных брионов и сырья для получения первичix культур клеток за счет увеличения титв в вируссодержащих жидкостях лантаисной и культуральной), 1782990 Таблица 1 Таблица 2 Зависимость титров вируса А/Виктория/36/72 (Н2Й2)от времени экспозиции куриных эмбрионов с пост, ЭМП 1000 Э Таблица 3 Показатели репродукции рекомбинантного штамма Х53-А после омагничивания КЭ пост. ЭМП 1000Э Формула изобретения 1. Способ размножения вирусов гриппа, включающий обработку электромагнитным полем куриных эмбрионов или культур клеток, их заражение, инкубацию и сбор вируссодержащей жидкости, о т л и ч à юшийся тем, что, с целью увеличения титров вируса, на куриные эмбрионы или культуры клеток воздействуют постоянным электромагнитным полем с напряженностью 1005000 Э в течение 5-40 мин или переменным электромагнитным полем 1000-5000 Э с периодом колебаний 50 — 60 с в течение 10-35 мин. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при использовании в качестве куль5 туры клеток куриных фибробластов воздействуют постоянным электромагнитным полем. З.Способпо п.1,отличающийся тем, что при использовании в качестве куль10 туры клеток свежетрипсинизированных клеток почек хомяка воздействуют переменным электромагнитным полем. 1782990 Таблица 4 Развернутая реакция гемагглютинации с алантоисной жидкостью вируса )(-53-А при определении инфекционныхтитров на КЗ П ри меча н и е. с — 10 по 10 - разведения вируса; 1), 2) и т,д. — номера пробирок с алантоисной жидкостью Таблица5 Репродукция вируса гриппа А/Ленинград/0139 (82N2) в культуре клеток КФ после обработки ее пост.311А 1000 Э, различное арена Дйи репродукции 7 (второй ypoeah) г о x«J ГЕ/нл х) Логарифм ЭИД ГЕ/мл «) ГЕ/мл Кратность прироста"> Титры ««) Время экспозиции (мин) Нет 4,6 0,4 16 Нет 4,g 0,2 3,0 Нет Нет l6 2 60 18 64 8 6,2 2 32 4 67 25 32 2 128 8 4 у g,4 6,4 1,7 2,4 3,4 2,7 32 2 3 0 8 - 4,2 3 0 Контроль П р и и е ч а и и е. К) - кратность прироста гемагглютиннрукцих титров хх) - -"- инфекционных тлтров логарифм ЭКД ькн логариФм ЭИД контроля. Табли ца6 средние генвггпотиннрущне н инфекционные титры вкрутив гриппа й/Ленинград/0139д/Техас/77 в внруссодервацед хндкостн клеток 062, обработанных в вввесн колеб.ЗДП Урокам вируса 10 днн репродукции Кратность прироста генагглотиннрукво титров Легар нвн З1Ь" /нг Кратность прироста Логарифм знд „ е ил Логарнен зкд Е/нл зреил воздеи Зйд,н генагглотиннрупщнх тит pos ЗЛДв,ь погврнфн зцд 5,54 7 ° 86 8 ° 65 6,00 16 l,18 1?8 1,18 256 0,48 64 7,52 8,70 8,70 8,00 64 128 107 32 7,11 64 2 8,23 64 2 8,57 32 8,79 16 2,32 3,11 0,46 1,7 1,12 1,46 1.59 5,45 6,70 7,95 6.90 3,? 1,6 5 ° 3 3>2. 20 1 ° 2 -32 2.2 :107 1,2 .64 48 64 128 7.30 8 ° 50 9 ° 50 8,50 32 64. 2 64. 2 7,20 8.07 8,76 7,90 1,3 2,6 1,3 1,25 2,50 1,45 0,87 1,56 0 ° 70 A. Контроль 6. Ко Рль 30 е 16 16 Кратность прироста ннйекционных.титров ° логарнон З 44урилк лога ривн злд Лога рифм Э11лз Кратность прироста генаггго тнннрупЫих титров Кратность ГЕ/нл прироста ннфекцн- 1 онных тит( ров, логаривн 6,0 у 4 6,7 4,7 Кратность прироста ннфекцион» ных титров, логарифм зид легар Ми зидв, I 1782990 таблица7 Репродукции вируса гриппа A/Xèåa/5979 а культуре клеток ПСХ, обработанных колеб. Ю1П «» « Стационарньй Роллерний «Ф» Логар и@и ЭИД /ип . «»«» «Ъ ГЕ/ил Кратность прироста Крат- ность прин роста Логарифи Э1Ц /ил Кратность прироста Кратность при» роста 53 64 12S 1,40 107 1,70 128 1,91 256 64 1 6 9,82 1 12 2 9,47 0,77 4 10,07 1,37 6,70 2 I 2 9,20 2 6 9,50 5,3 9,71 7 ° ЗО Контроль «« ««« » «« Таблица 8 Титры вируса Ф/Texacc/77 после обработки КЭ колеб. ЭМП в дозе 5000 Э различное время (П ри меча н ие. " Кратность прироста ГЕ-титров; "" Кратность прироста инфекционной активности. Редактор С. Кулакова Заказ 4490 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва. Ж-35, Рауаская наб., 4f5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Г ЮИ 4 5И ф М Составитель Г. Борискина Техред М.Моргентал Корректор M. Шароши
