Способ получения гриппозной вакцины

 

Изобретение относится к получе нию профилактических препаратов; а точнее к способу получения гриппозных вакцин. Целью изобретения является повышение иммуногенности гриппозных вакцин. Указанная цель достигается путем создания комплекса гемагглюти ни н неитраминидаз амурами лдипептидное производное. Данный комплекс попу чают при смешивании гемагглютикшг неитраминидазного комплекса со сме сью диметилпептидных производных в виде сложных эфиров с веществами, выбранными из группы: лецитин, холе стерин, дицетилфосфат или их смеси. Затем проводят солюбилизацию полу ченных комплексов поверхностно-актив ными веществами, которые удаляют диализом. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РШТУЬЛИН!, р„. : д,ЩТЕА

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

H. ОН

Н ОН

NHCOCH

CH СИСΠ— А-D- — тоИп

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

1ТРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4027675/13 (22) 05.06 ° 86 (31) 12334.1/85 ,(32) 06,06 ° 85 (33) JP (46) 23,05 91, Бюл. У 9 (71) Нэшнл институт оф Хелт, Даити сеяку Ко, Лтд и Джуридикл фаундейшн дзе кемо серотерапеутик рисерч институт (JP) (72) Куниаки Нероме, Акира Оя, Кунио Охкума и Апуо Иное (Л. ) (53) 615 ° 371:578i83! ° 2(088 ° 8) (56) Kotani et al. IAKUGAKU ZASSHJ

103(1), р, ) 27, 1983., (54) СПО СОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИ1П1ОЗНОЙ

: ВАКЦИНЫ (57) Изобретение относится к получеИзобре ение относится к поручению профилактических препаратов, а имен но гриппозных вакцин.

Целью изобретения является повы шение иммуногенности гриппозных вак цинв

Пример . 1 ° Используют высшие жирные сложные эфиры мурамилдипепти да формулы, И

Ъ где Q - остаток синтетической высшей

„.SU„„ i (51)5 А 61 К 39/145 нию профилактических препаратов, а точнее к способу получения гриппозных вакцин„ Целью изобретения является повышение иммуногенности гриппозных вакц;-;н, Указанная цель достигается путем создания комплекса гемагглюти нин-нейтраминидазамурамилдипептидное производное Данный комплекс полу» чают при смешивании гемагглютиинн» нейтраьинидазного комплекса со сме» сью д метиппептидных производных в виде сложных эфиров с веществами, выбранными из группы: лецитин, холе стерин, дицетилфосфат или их смеси, Затем проводят солюбилизапию полу ченных комплексов поверхностно-актив» g ными веществами, которые удаляют диализом. 2 табл. жирной кислоты, имеющей в це» лом 20-60 углеродных атомов;

А — или L-аланин, или l.-серии, или Глицин;

isoGln- изоглютамин.

Возможно также испопьзовать мурамилдипептидное производное формулы

CH ОН

СОХ Н2

WH-Acyl

СН C-x-NHCHCH

Ф 2

СН„СО-д

1651782 где Х - L-алании, 1-серин, 1-валин и глицин у

У представляет собой NH-А или

МНСН(СН ) — ИНСОА, гце R< — атом водорода, группа низшего алкила, карбоксимидогруппа или карбоксильная группа; и = 1-6; А— насыщенный или ненасыщенный алифатический углеводородный остаток, имеющий 8 30 углеродных атомов с разветвлениями или без них.

Более предпочтительный пример та»

К. ких производных включает N — ()1- эцетил мур амил-1-ал аиил-0-из о глу т ами нил )1) -стеароил-L-лизин, называемый как !

DP-LyS (L 18).

Более того предпочтительно ис- 2р пользовать N — (N-ацетилмурамил-11-ме тил»1-ал ани н-1)-и з о глу тами пил )-11Е-стеароил 1-лизин, называемый как

MDP- (МеАТа)- LyS.

Антиген гемаглютинин-нейтроминндаз ного комллекса (НАНА) получают операциями очистки вируса гриппа посредством высокоскоростного центрифужного разделения или химической обработки аллантоисной жидкости, собраннои из яиц, зараженных вирусами гриппа, растворения очищенного вируса с неионным поверхностно-активным веществом, таким как "Тритон Х-100" или "NP-40", или с анионным поверх35 ностно-активным веществом, таким как дозоксихолат натрия и холат натрия, или с катионным поверхностно-активным веществом, таким как цетилтриметиламмоний, или разложения очищенного вируса с органическими растворите лями, такими как эфир, с последующей очисткой полученного препарата центрифугированием.в градиенте плотности сахарозы с помощью аффинной 45 хроматографии или:т,.п.

Пример :1 Вирус гриппа А (Бангкок) 1/79 (Н.М ) выращивают в оплодотворяющих куриных яйцах и очищают выращенный вирус, подвергая ег высокоскоростному центрифужному разделению (23000 об /мин, 90 мин), низкоскоростному центрифужному раз делению (6000 об./мин, 60 мин), и центрифугированию в градиенте плот ности сахарозы (30000 об /мин, 3 ч).

Затем к полученному вирусному раствору добавляют "Тритон Х-100" в таком количестве, чтобы конечная концентрация "Тритона Х-100" стала 17., вирус растворяют путем тщательного. размешивания, после чего с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы получают очищенный раство антигена НАНА.

Используя полученный выше раствор очищенного антигена HANA, получают описанным способом четыре вида об» разцов вакцины, составы которых указаны в табл.:1.

Соответствующие составные части смешивают, а затем добавляют октилглюкозид в таком количестве, чтобы конечная концентрация глюкозида стала

3 мас l. После растворения ингредиентов осуществляют диализ в фосфатно буферный солевой раствор по известной методике ° концентрацию антигена

HANA в каждом полученном таким обра» зом образце доводят до 0,8 мкг 1)/мл, а затем инокулируют их при дозе

0,5 мл/мышь в брюшину каждой из

15 мышеи DDY (самки, 4 недели). После этого мышей разделяют на три груп пы по пять мышеи каждая и кровь со» бирают из мышеи соответствующих групп через одну, две и три недели и проводят испытание ингибирования гемагглютинации, чтобы измерить спо собность образования антитела, Мышей ПРУ также иммунизируют указанными соответствующими образцами аналогичным способом и заражают ви русом того штамма, который использовали для получения вакцины 2 недели спустя, Легкие у мышей удаляют через

4 дня Чтобы из мерить количество ви руса в легких, проводят на легких пробу с образованием пятна клетками

NDCK. Полученные результаты приведе» ны в табл, 1»

Из результатов, приведенных в табл,1, видно, что все вакцины обладают лучшей способностью образования антител по сравнению со сравнительной вакциной, состоящей только из

HANA.

С помощью электронного микроскопа устанавливают образование.искусственных везикулоподобных частиц мурамилдипептидного производного, Они имеют те же размеры и форму, что и природнь|е частицы вируса гриппа, при чем на поверхности этих частиц анти гены HANA связаны с мурамилдипептидным производным, образуя комплекс, 5 165

Для того, чтобы опр ед елит ь, обра» зует ли комплекс полученный выше образец 1, измеряют плотности антигена HANA всего вируса и образца 1 с помощью центрифугирования в гра диенте плотности сахарозы

Пример 2. Антиген HANA гото вят способом, указанным в примере 1, за исключением того, что используют, штамм гриппа A (Филиппинь.) ? /82 (H>N<) °

Антиген HANA смешивают с ингредиен- тами, приведенными в табл 2, после чего смесь подвергают ультразвуковой обработке в течение 8 мин с помощью ультразвукового излучателя, Способность образования антител каждого полученного таким образом образца измеряют аналогичным приме ру 1 способом.

11риведенные в табл.2 результаты показывают, что вакцины обладают хорошей способностью образования антител

Формула изобретения

Способ получения гриппозной вак цины, включающий заражение вирусом куриных эмбрионов, получение вируссодержащеи алантоисной жидкости, очистку вируса гриппа и выделение из него гемагглютинин-нейтраминидазного комплекса, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения иммуногенности целевого продукта, дополнительно осуществпяют смешивание . гемагглютинин-нейраминидаэного комплекса в массовом соотношении 1: 1-100 или с мурамилдипептидным производным, выбранным иэ группы веществ общей формулы, Н OH

Н0

5НСОСН

СН CHCQ — A— - P— - мсдп

Ф

1782 6 гДе Q — ocTRTOJ< B6icmel Н 6оА KHcJ10 ты, содержащей 20-60 атомо;,. углерода;

А - или L-алании или L-ce iин

У Э или глицин

isoGln -изоглютаьин и общей формулы

CH.ОЦ

СОХН2

N Н вЂ” Acyl

СН С-х-NHCHCH

3 2

СН,СО-V где Х - или алании, или серии, или

25 валин, или глицин;

Y представляет собой NH-A или1

11НСН (СН g) „- ИНСО-А, .где A — - насищенньп".- или ненасищенний, разветвленнььй или неразветвленньй 01, остаток, содержащий 8-30 атомов углерода, R „ — водород или алкильиая,,,или карбоксамидная, или карбоксиль.— ная группа, n = 1-6, или со смесью мурамилдипептидного производного с холестерином в массо вом соотношении 2:1-2, или со смесью мурамилдипептидного соединения в массовом соотношении 1 .1-20 с ле цитином, или смесью лецитина с ди™ цетилфосфатом в массовом соîтноше» нии 2-1.:1 с последующим растворением полученной смеси поверхностно-актив ным веществом, выбранным из группы: октипглюкозид и холат натрия, и уда-, 45 лением поверхностно, тивного вещества диализ ом

1б51782

Таблица 1

Способность образования антитела (значение ill) Обр тат испытания нонной защиты о став, мкг

1 неи, 2 нед.

3 не) личество ру са, сло /мл

НАНА 0,3 мкг N

ВЗО-MDP 50

HANA 0,8 мкг N

ВЗО ИОР 50

Холестерин 50

НАНА 0,8 мкг Н

ВЗО-ИОР 50

Лецитин 250

Дицетипфосфат 250

НАНА 0,8 мкг N

MDP-LYS (L18) 50

Лецитин 250

Днцетнлфосфат 250 (16

64 128

1О) Нет

128 256

10) Нет

32 64 Нет

10> (16

64 512 Нет

10) 5 (срав,i,нительный) 16 32 Есть 2 с 10

HANA 0,8 мкг N <10

Н1тамм А (Бангкок) 1/74 во всех составах

Таблица 2

Способность образования антител (Величина Н1) (спустя 3 нед) в, мкг

НАНА 1,0 мкг N, +.

ВЗО MDP 30

НАНА 1,0 мкг Н

ВЗО-МОР 30

Лецитин 450

Дицетилфосфат 50

НАБА 1,0 мкг N

Взо МОР 30

Холестерин 50

HANA 1,0 мкг N

ЮР-(1 18) 30

Лецитин 450

Дицетилфосфат 50

НАНА 1,0 мкг N

М1)Р-(L18) 30

Холестерин 50

512

512

1024

1024

512

11. (сравнительный) НАНА 1,0 мкг Н

256

Штамм А (Филлипины) 2/82 во всех .составах, l

Составитель С,Светлышев

ТехРед М. Дидык

Корректор Т.Палий

Редактор.Н,Лазаренко

Заказ 1б12 Тираж 4б1 Подписное

ВКИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101