Способ получения последовательности днк, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин а-1
Использование: генетическая инженерия , рекомбинантная технология получения . Сущность изобретения: способ получения последовательности заключается в том, что в вектор р BR322 клонируют фрагмент ДНК. полученный путем сшивки Batl-Pstt фрагмента, кодирующего аминокислоты + 15-+24 с фрагментом ДНК, кодирующим аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающим кодом инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот: -6, -1, +1, +3, +4,+5,+6,+7.+10,+11 и+1 , получают клоны и отбирают клоны, кодирующие человеческий проаполигтопротеин А-1. 7 ил.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РеспУБЛик (si)s С 12 N 15/12
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 4356123/13 (22) 26,05.88 (31) 8712540 (32) 28,05.87 (33) GB (46) 15.08.93. Бюл. N 30 (71) ЮЦБ, С,А, (BE) (72) Алекс Боллен, Жан Гобер (BE) и Эрнст
Вюльферт (ND) . (56) IP, N 96998/86, С 12 N 15/00, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЛЕДОВА-.
ТЕЛЬНОСТИ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ ФРАГМЕНТ КОДИРУЮЩИЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ
ПРОАПОЛИПОПРОТЕИН А-1
Изобретение касается способа получения новой последовательности дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин А-l.
Человеческий аполипопротеин А-1 (апо
А-I) является основным белковым составляк1щим липопротеинов высокой плотности (LH0) и хиломикронов лимфы. Печень и тонкая кишка являются основными центрами синтеза эпо А-I, Апо А-I синтезируется в этих органах в форме белкового предшественника(препроапо А — 1). Совместное трансляционное расщепление препептидэ происходит внутри клетки. и проапо А — I секретируется в плазме и в лимфе.
Проапо А — I содержит шесть дополнительных аминокислот (Arg — His — Phe — TrpGln-Gin), которые присоединяются к концевой эминогруппе апо А — I. Достигнув
„„5Ц „„1834904 АЗ (57) Использование: генетическая инженерия, рекомбинантная технология получения, Сущность изобретения: способ
- получения последовательности заключается в том, что в вектор р BR322 клонируют фрагмент ДНК, полученный путем сшивки
Ball — Рзт1 фрагмента. кодирующего аминокислоты+ 15 — +24 с фрагментом ДНК, кодирующим аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающим кодом инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот: -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 и+1 1, получают клоны и отбирают клоны, кодирующие человеческий проаполипопротеин А — 1. 7 ил, области расположения сосудов, проапо А-I расщепляется в условиях "ин вива" специфическим протеолитическим ферментом (апо А — 1 пропептидаза), образуя зрелый апо
А — I.
Этот зрелый апо А-1 представляет собой уникальный негликозилировэнный полипептид известный пос:едовэтельности, состоящий из 243 аминокислот (Н, В. Brewer и др., Biochem Biophys. Res. Commun 80, 1978 г., с. 623 — 630); он служит в качестве кофактора для плазматического фермента лицитинэ:холестеролацилтран рсферазы, которая ответственна за образование в плазме большинства сложных эфиров холестерина. Дефекты в структуре или биосинтезе аполипопротеина могут привести к нарушению в системе переноса плазматических липидов и к развитию заболевания коронарных артерий. Показано, что низкие
1834904 плазматические концентрации апо А-I и которым предшествует кодон ATG иницииLHD составляют значительный фактор рис- рования трансляции. Это приводит в река для сердечных припадков(инфаркт мио- зультате к тому, что полученный продукт карда) и для других заболеваний, связанных депрессии содержит N-терминальный метис атеросклерозом сосудов, В частности, му- 5 онин (соответствующий кодону ATG), кототации в гене, кодирующем апо А — I, связаны рый может вызвать побочные эффекты при со снижением концентрации LHO, а также с его использовании в терапии. преждевременными заболеваниями коро- Изобретение касается способа полученарных артерий, Апо А-I u LHQ являются ния человеческого проаполипопротеина А— основными составляющими плазмы. кото- 10 I, то есть зрелого белка проапо А — I, который рые участвуют в переносе холестерина пе- способен расщепляться специфическим риферических тканей (артерий) к печени. протеолитическим ферментом пропептида(иазываемый также обратным переносом зойапоА-I.Ïîäïîíÿòèåì "зрелый".испольхолестерина), экстретируясь организмом. зуемым в данном контексте, имеется в виде
Принимая во внимание то, что накопление 15 не только человеческий проапо А-I как такохолестерина в артериях является наиболее вой, но также и соответствующий белок, важной особенностью и механизмом этеро- первая аминокислота которого предстаалясклероза, стимуляция обратного переноса ет собой метионин, и присутствие которого холестеринапосредствомапоА-I можетзэ- обусловлено ATC кодоном инициирования медлить и преобразовать атеросклеротиче- 20 трансляции в построении вектора экспресский процесс и тем самым снизить случаи сии. сердечных припадков. Благодаря данному способу получения, Созревание проэпо А-1 a ano А-1 может человеческий проапо А-I полностью освоосуществляться количественно вне клетки божден от обычных эндогенных белков и по мере нахождения в крови в течение ме- 25 других исходных материалов или продуктов. нее i 2 часов. Принимая во внимание то, что Изобретение относится к способу полпроапо А-I является основным, если ие учения последовательности ДНК, содержаединственным, предшественником зрелого щей фрагмент, кодирующий человеческий апо А-l, он может быть использовэи в заме- проаполипопротеина А — I, предусматривая стительиой терапии каждый рээ. когда сии- 30 получение клонов ДНК путем клонирования жается концентрация LHD, например, при двунитевой комплементарной ДНК в наследственных или приобретенных поро- РВЙ322, выбор клона, кодирующего преках, Ввиду терапевтической цЬинвсти апо проэполипопротеии А — I, выделение послеА-I, исследователи делали попытки paspa- довэтельности ДНК из выбранного клона и ботать способы, позволяющие продуциро- 35 характеризуется тем, что в целях обеспечевать апо А-t в больших количествах. Такие ния наилучшей экспрессии человеческого общеизвестные способы включают очистку проэполипопротеина А-I, при помощи ДНК апа А-t, полученного в кровяной плэаме. — лигазы Т4, связывают фрагмент ДН К Bai 1
Из публикаций (Р. Cheung u L Chan, - Pst1 кодирующий аминокислоты с+15 по
NucIelc Acids Res., 11, 1983 г., 3703-3715; 40 +243 препроаполипопротеина А-I, в конце
Л. ЯеИЬаяег и др., l3MA, 3. 1984 г., 309-317. синтетического фрагмента, имеющего пои японская патентная заявка М 96998/86) следовательность ДНК (указана одинарная известно, что комплементарная ДНК, кади- цепочка): рующая препроапо A-1, может быть получе- 5 -ATGAGACATTTCTGGCAG CAGGACG на способами генетики. 45 AACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTA
Так, R, Lorenzetti и др. (FEBS Iett 194, А66АСТТ6 — 3
1986 г., 343-346) показали, что апо А-I мо- кодирующую аминокислоты с -6 до+14 полжет быть экспрессирован в Е. сой в форме ипептида и содержащую кодом инициации белка, слитого с нерасщепляемой бета-га- трансляции и модифицированные кодоны лактозидазой. Однако попытки экспресси- 50 для аминокислот -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, ровать зрелый апо А-I в форме неслитого +10,+11и+14.Последовательностьмодифибелка остались безуспешными. В японской цированной ДНК, полученной. согласно патентной заявке N. 96998/86 описывается способу настоящего изобретения. находит экспрессия белка подобного человеческому важное применение в конструировании векаполиполротеину А-1, е Е. call которнй оо тора клонирования и зкспрессии. содержатрансформируется плазмидой pHAIE I, со- щего зту последовательность ДН К, держащей ген со структурой апо А — I, под кодирующую человеческий проапо А-i, что контролем промоторэ я с, Однако данный дает амплификацию, а, следовательно, эксструктурный ген является неполным и со- прессию зрелого человеческого проапо А-I стоит из кодонов аминокислот от+4 до+243, и мет-npoan0 A — I; его конъюгатов слияния
1334904 или его коньюгатов с N-концевым сигналом, культурами жизнеспособных клеток или генетически модифицированных микроорганизмов,. содержащих такие векторы, и способных продуцировать полипептиды человеческого проапо А — I в физическом состоянии, отличном от того, который обнаруживают или выделяют из. источника или естественного окружения. Полученный человеческий проапо А — I в значительной мере освобожден от обычных эндогенных белков и других исходных материалов и продуктов.
Белок, продуцируемый клетками или микроорганизмами, модифицированными последовательностью ДН К, полученной согласно способу настоящего изобретения, состоит из или содержит зрелый человеческий проапо А — I, который в таком случае может быть превращен в условиях 1п иш>. или i cvivо а арелии челоееческии ало А-! путем протеолитического действия апо А — t пропептидазы. Полученный человеческий проапо А-1 может быть использован как таковой в терапевтических целях; может быть также использован мет-проапо А — 1, если присутствие метионилового радикала фармацевтически приемлемо, т.к. данный продукт может быть естественным образом и эффективно превращен в ток циркулирующей крови натуральной пропептидазой, в аутентный зрелый человеческий апо А — 1.
При желании, человеческий проапо А-1 может быть продуцирован в отобранных микроорганизмах или клеточных культурах, которые способны воздействовать на Nконцевой метионин, и, следовательно, способны продуцировать человеческий проапо
А-1 в форме, не содержащей N-концевой метионин. Другими словами, человеческий проапо А — I содержит или не содержит Nконцевой метиониловый радикал, может быть расщеплен в условиях in vitro с обра зованием зрелого человеческого апо А-I, который может быть использован в терапевтических целях. Это же относится и к конъюгатам слияния и коньюгатам, включающим сигнальный N-терминал проапо Аi; расщепление этого продукта приводит к образованию аутентного человеческого апо
А — I, лишенного N-концевого метионина.
Установлено, что эффективная экспрессия может гарантироваться за счет соответствующей модификации некоторых кодонов в последовательности, кодирующей аминокислоты от -6 до +14 человеческого проапо
А — !. Понятие "соответствующая модификация" в данном контексте означает, что некоторые естественные кодоны заменяются другими кодонами, которые. согласно гене50 контролем промотора Fh фага лямбда. Эти плазмиды представляют собой векторы экспрессии. которые пригодны для Е. co!I u направляют синтез человеческого проапо
А-1, который может быть расщеплен пропептидазой с образованием зрело-о аутентного человеческого апо А — 1. При вводе в =„.
coli плазмида puL B9296 направляет зкспресслитого белка, содержащего бета-галактозидазу и человеческий проапо А-!, под контролем зоны стимулятора IBc. Е. coli. Ecли учесть То. что данный продукт слияния содер>кит еще последовательность расщептическому коду, предстэвляют собой те же аминокислоты и, кроме того, это понятие означает, что все взятые совместно модификации приводят к снижению или даже к полному устранению образования булавочных структур. Следует подчеркнуть. что такие модификации последовательности ДНК не оказывают никакого влияния на тип точки расщепления -пропептидазы ввиду того, что аминокислотная последовательность, распознаваемая пропептидазой, сохраняется в данном построении.
Продуцируемый белок, является продуктом культуры клеток или генетически модифицированного микроорганизма и может быть представлен в форме зрелого проапо
А — 1, в форме зрелого проапо А — 1, которому предшествует радикал метионина, в форме слитого белка, такого как, например, бета20 галактозидаза-проапо А-I, и в форме соединения препроапо А-l.
Культура клеток или микроорганизмов, используемые для данного продуцирования, не ограничиваются клеточными линия25 ми и специфическими организмами: могут использоваться как прокариотические клетки, так и эйкариотические клетки, включая линии клеток животных и человека, Лишь с целью иллюстрации ниже дается пример экспрессии в бактерии Е coli (как представителя прокариотических клеток) и в дро>кжах Sa cchacomóààh CCCCrisicg, a также а клетках насекомых, зараженных бакуловирусом (как представителей эйкаристических клеток).
Реплицируемыми векторами клонирования и векторами экспрессии, содержащими последовательность ДНК, полученную согласно изобретению, и используемыми в
40 примерах являются рекомбинантные плазмиды PUL В9291, ри1 Â9292, ри1 Б9296, ри1
В9299, pN !Убl2 и pN 1т 1613, построение которых будет представлено ниже. Первые названные плазмиды, ри1 В9291 и pv1
В9292 содержат ген с модифицированной структурой проапо А — 1, которому предшествует кодон ATG, и который находится под
1834904 пения пропептидазы, то он может быть расщеплен с образованием аутентного зрелого человеческого апо А-.I.
Плазмида puL В9299 представляет собой вектор экспрессии, пригодный для дрожжей и содержащий зоны промотора и терминатора транскрипции AR ющий гарантировать эффективную экспрессию в дрожжах, Полученный человеческий проапо А-1 может быть снова расщеплен пропептидазой с образованием аутентного зрелого человеческого апо А-I, Плаэмида pN 171612 содержит ген со структурой проапо А-1, слитый с последовательностью ДНК сигнального пептидэ белка
0mpA Е. соП и под контролем промотора 1ро (лииопротеина) и промотора-оператора lac.
В данном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид сппрД предшествует последовательности проапо
А-1 без ATG кодона инициирования трансляции, Эта плазмида представляет собой вектор секреции подходящий для Е. со11 и направляет синтез человеческого проапо А1, который может быть секретирован в периплазме без N-терминального метионина.
Плазмида pN IY1613 представляет собой вектор переноса для ввода последовательности ДНКс человеческого проапо А-1 в бакуловирус. Она включает полигедриновый промотор бакуловируса и ген со структурой проапо А-I, включая ATG кодон инициирования трансляции.
Совместно с естественным источником бакуловируса (вирус ядерного полигедриозиса Аиiо9гарйа caiiforr)ICa AcNPN), плазмида pNIY1613 направляет синтез проэпо А — I в клетках насекомых и может снова освобождаться от метионина после пост-трансляционных модификаций в клетках насекомых.
В зависимости от типа используемого вектора и от выбранного хозяина может ис. пользоваться любой прием генетики, пригодный для достижения желаемой генетической модификации. включая трансфекцию. трансдукцию и др.
Данное изобретение осуществляется со штаммом ММ 294 микроорганизма Е,соИ
K12 ((no АЩ, Наса, s uE); этот штамм был сдан на хранение был сдан на хранение в
Коллекцию культур американского типа (АТСС М 33625) без ограничения в отношении его доступности.
Тем не менее, могут быть использованы другие микробные втэммы, включающие известные штаммы Есо11, такие как 1=.„арЦ
В, х 1776 (ATCC М 31537, депонирован 3 июля 1979 года, без ограничения),Д=,.
colt AR 88. ороиоводиоо от СС 00 (ATCC )k
40 пликации для обеспечения гарантии амплификации в хозяине. Эта гетерологическая вставка может быть снова экспрессирована таким образом, чтобы получить экспрессию одновременно с предыдущей слитой последовательностью, происходящей, например, от генов системы lас.
Эти векторы экспрессии бакуловируса, например pAcRP6 и pAcYMI (J, Matsuura u другие. J, Gen. virof, 68, 1987 r., стр. 12331250) и бакуловирус дикого типа (вирус гитик со)1)ого)рд AcNPV) широко исоольэуютск s настоящее время. Они подробно описаны в литературе и могут быть получены в основном согласно способу, используемому на
Техасской экспериментальной сельскохозяйственной станции.
8 качестве хозяина можно использовать также различные клетки насекомых для совместимых векторов экспрессии, напри33956) с clll, cl 857, bio функции дельта Н, лишенные лямбда, поставляемый PLPHARMACIA(YEM0++ и др., Proc. Nr)ti. Acad
Sci, США, 82, 1985r., стр. 88-92; G Devare u
Б др.. Cell, 38 1984 г., стр. 43-49), Е, coll l M
101(AT CGA 33878)(1. Messing и др.. Nuclels
Acids Res 9, 1981 г., стр. 309 — 321), или Е, coll
J А221(lрр-. hacM+. trp Е5, leu Вб, lac Y, гес
А1!Р, lас i, lac+, рго+) (J. Ghrayeb и др., 10 ЗМВО J6 3. 1984 г„стр. 2437 — 2442), или другие микробные штаммы, многие из которых депонированы и доступны согласно положению о депонировании известных микроорганизмов, таких как микроорганиз15 мы культур американского типа (АТСС) —— смотри перечни каталога ATCC. Эти микроорганизмы включают, например, ВасИ11, такие как Basillus subtllis и другие кишечные бактерии, из которых можно назвать, напри20 мер, Sslm oneltð Tu3Lhrimurium и Serrsrls
)т)агсеээапз с использованием плазмид, которые могут реплицироваться и выражать последовательности гетерологических ненов.
Плаэмиды экспрессии для применения
25 в отношении бактерий, например. E cöÖ, обычно получаются из плазмиды pBR322, используемой в качестве вектора (депонирована в ATCC под номером 37017) и путем вставки соответствующим образом после30 довательности гетерологического гена одновременно с сигналами инициирования и завершения трансляции, в фазе считывания, точно соответствующей функциональному промотору, с преимущественным отбором естественных или искусственно образованных ограничительных точек, Данный вектор будет являться носителем одного или нескольких характеристических генов отбора по фенотипу и источника ре1834904
10 мер клетки Едобо тега frugiperde Sf9 (M.D.
Summer u G.Å. Smith, Справочное руководство по методам для векторов бакуловирусов и по обработке клеточных культур насекомых, Техасский университет, Колледж Стэшн, 1987 г., ATCC СК1 1711).
Могут быть использованы различные штэммы дрожжей, заключающие в себе совместимые векторы экспрессии, такие как плазмида YR р7 (Р,T, Stlnchcomb и др., Nature, 282, 1979, стр. 39-43), которая способна к отбору и репликации одновременно в Е. coli и в дрожжах, в частности, Еасс(тагошусев cerevie iaä.
Штаммы дрожжей, которые могут быть использованы, представляют собой штамм
PH218 (G. Mlozzari и др., J. Bacteriol, 134;
1978 г., стр. 49 — 59), депонированный в Коллекции культур американского типа без огрэничения (АТСС № 44076), штамм 10S44c (T. Cabezon и др., Proc. Natl. Acad. Sci, США, 81, 1984 г., стр. 6594 — 6598), который имеет генотип leu 2-3, leu 2-112, рер 4-3. (M.
Hoylaerts и др., FEBS lett, 204, 1986 г., стр.
83-87) и штамм Ic 1697 d (erg J, leu 2-1 брадитрофныи для ергинин ATCC N.
20631).
Для экспрессии гетерологического гена, такого как ДНКс для человеческого проапо А-I в дрожжах, необходимо построение плазмидного вектора, включающего четыре составляющих компонента. Первым составляющим компонентом является фрагмент, который обеспечивает трансформацию одновременно Е. coll и дрожжеи, и которыи должен, следоеателвно, содержать ген отбора, происходящий от raæäoro организма.
Это может быть ген, ответственный за стойкость к ампициллииу, происходящий от Е.
cali (см. "Ampa") и ген leu 2, происходящий, от дрожжей. Этот составля ющий компонент требует также источника репликации, происходящего от каждого организма. для того чтобы сохраняться как плазмидная ДНК в этих двух организмах. Это может быть источник E coli, происходящий от pBR322 и источник «ад((хромосомы 1И дрожжей или источник репликации круговой ДНК 2,и.
Вторым составляющим компонентом плэзмиды является последовательность, расположенная в положении 5 сильно экспрессированного гена дрожжей для осуществления транскрипции помещенного ниже структурного гена. Данная последовательность, расположенная в положении 5, может быть последовательностью, происходящей от генов ТОН 1 или ARG3 дрожжей, Этот фрагмент построен таким образом, что исключает структурные последовательности TDH3 или ARG3, которые за55 дин; 1, изолейцин; К, лизин; L, лейцин; М, метионин; N, аспарагин; Р, пролин; 0. глутамии; R, аргинин; S, серии; Т, треонин; Ч, валин; W. триптофан; и У, тирозин.
На фиг. 2 представлена схема синтеза олигонуклеотидного адаптера для построе5
50 менены последовательностью, содержащей альтернативные Ограничительные точки. например ограничительные точки Ncol или
BamHl äëÿ благоприятного связывания этой последовательности, расположенной в положении 5 . со структурным геном.
Третьим составляющим компонентом системы является структурный геи, построенный таким образом, что содержит одновременно ATG сигнал инициирования трансляции и сигнал завершения трансляции.
Четвертым составляющим компонентом является ДНК последовательность дрожжей, содержащая последовательность, расположенную в положении 3 дрожжевого гена, которая заключает B себе соответствующие сигналы прекращения транскрипции и полиаденилирования. Так, например, плазмиды, направляющие продуцирование человеческого проапро А — I в дрожжах, могут быть построены путем вставки фрагментов гена полипептида человеческого провора Д-l в точку BAmHI плавмиды выражения pRIT 10774. оп исаи пои в евролеяскои патентной заявке ¹ 151102.
Дополнительные отличительные особенности настоящего изобретения будут ясны из последующего описания предпочтительных пост(оений векторов, включающих последовательность ДНК, отвечающей данному изобретению, и условий, в которых эти векторы могут быть полезно использованы. Далее будет дана ссылка на рисунки, В которь(х:
На фиг. 1а и б показана последователь- ность нуклеотидов и аминокислот человеческого препроапо А — I. Последовательность нуклеотидов информационной PHK человеческого препроапо A-(определена, исходя из анализа ДНК последовательности ДНКс клона pULB1609. Аминокислоты, имеющиеся в сигнальном пептиде, в пропептиде и в полипептиде зрелого апо А-1, идентичны и имеют нумерацию от первой аминокислотной группы белка апо А — I.
Подчеркнута область, соответствующая отобранной пробе синтетической ДНК, используемой для выделения данного клона.
Буквенные аббревиатуры. используемые для обозначения аминокислот, имеют следующие значения: А, алании; С, цистеин; D, аспаргиновая кислота; Е, глутаминовая кислота; F, феиилаланин; G, глицин; Н, гисти1834904 ния фрагмента ДНК, кодирующего 6 аминокислот пропептида и 14 первых аминокислот полипептида зрелого апо А-! с ATG кодоном инициирования. Стрелки показывают олигонуклеотиды, используемые для синтеза фрагмента Ncoi ВАО на 66/61 основных пар (вр,), На фиг. 3 показано построениеплазмиды рЯ 89291, которая несет регуляторные
10 зоны лямбда Р1 и последовательность нуклеотидов проапо А-l; на фиг. 4 — построение плазмиды pUL B9296, которая несет промотор lac u E. coll и последовательность нуклеотидов бетагалактоэидаэы. слитой с последовательностью проапо A-l; на фиг. 5 — построение плазмиды pUi В9299, которая несет регуляторные зоны ABG3 дрожжей и последовательность нуклеотидов проапо А—
l; на фиг.:6а,б,с — построение плазмиды
pNlY1612, которая несет регуляторные зо- 20 ны lac и 1щ последовательность, кодируюпГулг сигнальный пепгид алга А, н последовагельность нуклеотидов проапо А—
i; на фиг. 7 — построение плаэмиды
pN1Y1613, которая заключает в себе регуляторную зону гена полигедрина и последовательность нуклеотидов проапо A-l. той же обратной транскриптазы в качестве фермента. Препараты ДНКс db, обычно в количестве 1 мкг, обрабатываются Sl нуклеазой. с образованием явных концов. Эти процедуры хорошо известны для специалистов в данной области и подобно описаны
Maniatis и др., указывалось выше, Затем
ДНКс бЬ вытягивается путем удлинения олиго (dC) согласно способу, описанному L.
Получение рибонуклеиновых кислот:
Общая рибонуклеиновая кислота печени 30 получается из хлористого соединения гуанидина (R.À. Сох, Методы в энзимологии, ХП, часть В, 1968 г„стр. 120 — 129), Данный препарат общей рибонуклеиновой кислоты
{РНК) затем пропускается через колонку с 35 олиго (бТ)-целлюлозой для получения общих поли А РНК (Т. Maniatis и др., Молекулярное клонирование, Cold Spring Harba
Laboratory Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1982 г.), Из 10 граммов человеческой печени 40 получается 200 мкг поли А РНК.
Синтез дополнительной ДНК (ДНКс) в условиях ин витро.
Реакции обратной транскрипции, с использованием в качестве исходного продук- 45 та 0.1-5 мкг поли А PHK осуществляются с участием олиго (dT)12-18 (примерно 1 мкг; источник: BOEHRlNGER). Затем эта однониточная ДНКс преобразуется в молекулу с двойной нитью (ДНКс db) с использованием 50
Villa — Komaroff и др, (Proc. Natl. Acad Scl, США, 75, 1978 г., с. 3327 — 3731). Обычно осуществляется обработка 100 нг ДНКс db ферментом терминальной деоксинуклеотидилтрансферазой.
Обычно удлинения, соответствующие
15основаниям, присоединяются к 3 концам молекулы ДНКс db, Клонирование вытянутой ДНКс db в плазмидный вектор pBR 322.
ДНК плазмиды pBR 322 линейно выравнивается посредством фермента Pstl и вытягивается посредством удлинений олиго (dG) согласно способу, описанному R,M.
Lawh и др., (й ис1е 1с Асй з Res. 9, 1981 r., стр.
6103-6114).
ДНКс db. вытянутые удлинениями олиго (dC), смешиваются в равномолекулярных пропорциях сДНК плазмиды pBR 322, вытянутой. посредством олиго (dG).
Обычно для рециркуляризации плазмиды гибоидизируются 50 мкг смеси. Эти условия хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описываются в работе R.Ì, Lawn и др., см. выше, Затем эта смесь гибридизации используется для трансформации компетентных клеток, например, штамма ММ294 Е. coil, согласно способу. описанному R,M. Lawn и др., см. выше. Несколько сотен трансформант получается путем ростового отбора в среде тетрациклина, причем стойкость к этому антибиотику сообщается плазмидой pBR
322. Трансформанты были испытаны также на их чувствительность к ампициллину. Те
413 них, которые проявляли чувствительность, содержали химеровую плазмиду, поскольку вставка инородной ДНК в вектор инактивирует ген ампициллина. и от
Трансформанты E. cali отсеиваются посредством синтезированных олигонуклеотидов, меченых у конца 5 изотопом 32Р. соответствующих фрагменту гена апо А-1.
Такая последовательность нуклеотидов человеческого апо А-1 уже известна (см. P.
Chetng u L. Chan. cM. вьiше. и J.1. Seiihamer и др.. см. выше); таким образом, осуществляют практически химический синтез по способу N.О. Slnda и др, (Nucleic Acids, Res.
12, 1984 г.. стр, 4539-4557) фрагмента олигонуклеотидов длиной, соответствующий 22 основаниям, соответствующих 5 концу гена. Отобранная последовательность представляет собой:
5 — G CTGCGGTG CTGACCTTGG CCG — 3 .
Перед использованием для гибридизации синтезированной олигонуклеотид фосфорилируется у его 5 конца
14
1834904
13 полинуклеотидокиназой Т4 (P
8iochemlcals и (гамма — 32P) аденозинтиофосфатом. Условия мечения и гибридизации хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе Т, Maniatis и др„см. выше, а также в работе
Ва11еп А. и др„(ОНА, 2, 1983 г„стр. 255-264).
Построение плазмиды выраженьищя, Способы получения ДНК для выделения фрагментов ДНК, а также условия анализа посредством ограничительных ферментов и условия сшивки фрагментов харашо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе R.M. Lawn и др„ см, выше, и в работе Т. Cabezon и др., см. выше, и применяются в настоящей работе.
Синтез фрагментов NCOI-Ball.
На рисунке 2 показаны в деталях принципы, лежащие в основе концепции 35— мерных, 30 — мерных, 18 — мерных и 43— мерных олигонуклеотидов, используемых в синтезе фрагмента НСО1-ВАИ на 65/61 основных пар (рВ). Эти сйнтезированные 30мерные и 18 — мерные фрагменты фосфорилируются у них 5 концов посредством полинуклеотидокинаэы Т4 (Р— L 8 iochemicals), 1 мкг каждого олигонуклеотида, включая нефосфорилированные 35 — мер и 43 — мер. гибридизируются в течение трех минут при
95 С в 300 мМол ацетата натрия (рН =- 7,0); затем медленно охлаждаются при 4 С, Смесь гибридизации используется как таковая в операции клонирования для построения плаэмид выражения, Определение последовательности аминокислатных остатков ЛНК
Анализ последовательности ДНК осуществляется согласно способу. описанному
A.M. Maxim u W. Gilbert (Proc Matt. Асад Sci
США, 74, 1977 r., стр. 560 — 564 и Г. Sanger u др. (Proc. Natl. Асад, Sci, США. 74. 1977 r„ стр, 5463-5467), Анэлизбелкав, Скопление клеток, имеющих оптическую плотность в пределах от 1 до 630 нм (100630) получали в различных этапах в ïðîцессе брожения штаммав, несущих плазмиды выражения человеческого проапо А-l, риl 89291, pul 89292, pul 89296 и pul 89299 (трансформированы соответственно в штаммах AR58 и IM101 Ecoii и в штамме
10S44c дрожжей). Каждый образец переводился в суспензи а в 50 мМол Трис-НС! буфера, рН вЂ”.: 6,8. содержащем 2
50 дадецилсульфата натрия (DSS), 6 Мол, моче- 55 вины, 10 глицерина и 5 2-меркэптоэтанала, и этот буферный раствор нагревался при кипении в течении трех минут, Образцы подвергались электрофареэу на полиакриламидных гелях (IJ.K. Lacmmli. Nature?27.
1970 г, 680-685), Общие белки обнаруживались путем окрэшивания синим Комассье, и синтезированный человеческий праапо А †идентифицировался путем иммунологического распознавания после электрофорестического переноса (сматри А, Bollen и др„ см. выше).
Построение рекомбинантных векторов для экспрессии человеческого проапо А-i в бактериях, в дрожжах и в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом
1, Клон ДНКс для человеческого препроапо А — 1: ри1 В1609 (фиг. 1).
Было отобрано несколько сотен трансформант, получаемых при клонировании
ДНКс db, соответствующей поли А+ РНК человеческой печени, а точку PStl плаэмиды
pHR322, с помощью синтезированного пробника 22 — мерного апо А — 1, описанного выше. Один из клонов дает интенсивный сигнал гибридизации в ходе выделен, и данная вставка ДНК, присутствующая в рекомбинантной плазмиде, была охарактеризована путем анализа последовательности данной ДНК, Ее длина соответствует 878 парам оснований (Ьр); ана кодирует полный палипептид препраапо А-!. Кэк показано на рисунке 1, данный клонированный фрагмент ДНКс несет некодирующие зоны в 5 и 3 положениях (19
sp и 55 вр, соответственно), последовательность на 54 вр, кадирующу о пептидный предшественник (от аа — 24 до аа-7), последовательность нэ 18 бр, кодирующую пропептид (от аа-6 до аа-1) и последовательность на 732 Ьр, кадирующую зрелый апо А-1 (от аа+1 до аа+243), и включает кодан завершения трансляции. Данная последовательность белка, взятая иэ последовательности ДНК, абсал отно точно соответствует обнаруженным аминокислотам для препраапо Л-I из данного белка и иэ клонов ДНКс, выделенных изолированно друг от друга (W.Ñ, Na" кег и др., Сап;р.
Piochem. PhysioI 578, 1977 r., стр. 309-315;
Патентная заявка Японии ¹ 96998/86; Р .
Cheung u L. Chan, cM. выше, и.I.J. Seiihamer и др.. см. выше).
2, Построение бактериального вектора экспрессии, включающего последогательность ДНКс человеческого праапо А--I: puI
89291 (фиг. 2 и 3), Была построена pul 89291, плазмида, нрадуцирующэя человеческий t1poal10 А — I путем расположения сегмента. происходящего от клона р0(81609, за регуляторным праматаром лямбда Р1 (рис. 3). Построение этой плаэмиды экспрессии требует сингеза
1834904 фрагментов ДНК, включающих ограничительную точку ЙЯДЯТО кодон инициирования трансляции и последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислоты от аминированного конца гена со структурой человеческого проапо А-l, до первой уникальной ограничительной точки, ВаП (фиг.
2).
Такой адаптер синтезируется химическими методами (N.D. Slnha и др., см. выше), Получено четыре синтезированных олигонуклеотида; после гибридизации они кодируют метионин, соответствующий ATG кодону инициирования трансляции, для шести аминокислот, соответствующих пропептиду, и для 14 первых аминокислот зрелого ,человеческого апо А — I (рисунок 2). Этот синтезированный адаптер служит для снижения до минимума образования вторичных структур у конца 5 гена. Для этого кодоны, отобранные для кодирования аминокислотных групп -6, -1, 1, 3, 4, 5. 6, 7, 10, 11 и 14, не соответствуют естественным кодонам. имеющимся в ДНКс клона рЫ 81609.
Описанный выше синтезированный адаптер используется для присоединения фрагмента ДИК на 744 рЬ, происходящего от pul 81609, к промотору яямбда Р1 в плазмиде экспрессии pul 81221.
Построение вектора экспрессии pul
81221 описано в европейской патентной заявке М 186.643. Оно включает три основных этапа. начиная от плазмиды рСОЧ g. Плазмида pCQV2 описана Queen С. в!. Мо!, Арр1.
Genet. 2, 1983 н.. стр. 1-10, и легко доступна.
Выбор данного типа вектора необязателен: может быть использован любой другой вектор, имеющий промотор, и расположенную ниже от него подходящую точку NC01.
Примерно 0,1 мкг синтезированных фрагментов, таких как описаны выше, сшиваются посредством ДНК лигазы Т4, примерно с
1 мкг фрагмента ВаИ вЂ” PSti на 744 рЬ, происходящего от pui 81609 и примерно с мкг плазмидного вектора pUL 81221, отсеченного МСО! и ВаП. До осуществления операции сшивки фрагмент Ва11 — РЫ на 744 рЬ основных пары обрабатывается ДНК полимеразой Т4 таким обра ом. чтобы происходило преобразование вытянутых концов в положении 3 в свободные концы. Данная процедура хорошо известна для специалистов в данной области и подробно описана
Т. Maniatis и др., см. выше.
После амплификации в компетентных клетках штамма AR58 Е. соИ перестроенные плазмиды характеризуются путем анализа ограничительных точек и анализа последовательности ДНК синтезированных фрагментов и точек соединения, Рекомбинантная плазмида pUL 89291 отвечает всем критериям, поскольку она имеет фрагменты в правильной ориентации и в правильном по5 рядке. Она используется для изучения выражения.
3. Построение бактериального вектора экспрессии, содержащего слитые последовательности, соответствующие бета-галак10 гозидазе и человеческому проапо А-1: pul
89296 (фиг. 4).
8 данном построении последовательность ДНК, кодирующая человеческий проапо А-1, сливается в фазе правильного
15 считывания ниже последовательности ДНК бета-галактоэидазы. Ген бетагалактозидазы присутствует в плаэмиде экспрессии Е. col!
pUR288, являющейся легко доступной (О.
Ruther и Мо11ег-HI!I, EMBO 3, 2, 1983 г„
20 1971-1794), которая несет эффективно индуктируемый промотор lас с соответствующие ограничительные точки в последовательности бета-галактозидаэы, Была построена соответствующая рекомби25 нантная плазмида, как показано на рисунке
4. Прежде всего ДНК плазмиды puR228 отсекается BAMHI, затем обрабатывается
ДНК полимеразой Т4 и снова отсекается
SAII. Затем фрагмент ДНК на 805 рЬ отделя30 ется от pUL 89291 путем последовательных операций выравнивания с Крп1, обработки
ДНК полимеразой Т4 и конечного выравнивания с SaH. Эти два фрагмента сшиваются друг с другом s молярных пропорциях по35 средством ДНК лигазы Т4, и полученная плазмида используется для трансформации компетентных клеток штамма J M101 ЕЕ. сф1, который является широко распространенным и легко доступным штаммом (АТСС N
40 33876). Трансформанты характеризуются путем ограничительного анализа на правильную ориентацию последовательности человеческого препро А-1 по отношению к гену бета-галактозидазы и на присутствие
45 воспроизводимой точки ВааЮ на стыке двух последовательностей. Это показывает, ° что последовательность человеческого проапо А-1 хорошо слита ниже последовательности ДНК бета-галактозидазы и в фазе
50 правильного считывания. Одна из трансфармант, содержащая плазмиду pul89296, отвечает всем критериям и используется в экспериментах на определение выражения.
4. Построение алазмиды экспрессии
55 дрожжевого носителя последовательности
ДНКс человеческого npoaito А-1: pul 89299 (фиг. 5).
В данном построении последовательность ДНКс, кодирующая человеческий про1834904
10
20
50 апо А-l, клонируется между сигналами промотора и терминатора, которые несет плээмида выражения дрожжей. Для настоящего эксперимен-.а выбран данный вектор выражения дрожжей pRIT 10774, Такое построение алаэмиды выражения pRIT 10774 описано в европейской патентной заявке
151.102. Она построена, с одной стороны, из плэзмиды pRTI 10749, депонированной в
АТСС под номером 39133, в соответствии с положениями Будапештского соглашения, и, с другой стороны, иэ челночного вектора
УЕ р13 для Е. со!! — S cerevligl+, описанного
J.R. Breach и др., à Gem 8, 1979 г., стр.
121-133, и который хранится в ЛТСС под номером 37115 и легко доступен. Вектор
pRIT 10774 может реплицироваться одновременно в Е. coli и в дрожжах и несет промотор и терминатор транскрипции орнитинкарбамаилтрансфераэы (ARG3), разделенных уникальной ограничительной точкой BamHI, приемлемой для вставки инородной ДНК, имеющей свой собственной
ATG кодон инициирования трансляции. КроМе того, данный вектор несет последовательности 2 дрожжей, метаболические маркеры для отбора в дрожжах и марке отбора AmpA для челночного вектора в Е. coli.
Это не единственный вектор, который Может быть использован для выражения человеческого проапо А-! в дрожжах: может быть использован любой другой вектор для дрожжевого носителя рег/ляторного сигнала, и это приводит к качественно одинаковым результатам. Построение. иллюстрированное на фиг. 5. осуществляется следующим образом. ДН К плазмиды pRIT
10774 линейно вь. равнивэется посредством фермента B am Hl и обрабатывается ДН К пол имерэзой Т4.
С другой стороны, фрагмент ДНК на 810
pb отделяется от pul В9291 путем вываривания с ферментами Азр718 и За!!, с последующей обработкой ДНК полимераэой Т4.
Этот фрагмент кодирует человеческий проапо А — f и включает ATG кодон инициирования трансляции. Эти двэ фрагмента, полученные как описано выше, сшиваются друг с другом в равномолярных пропорциях пос редством ДН К лигазы Т4, и данная смесь используется для трансформации компетентных клеток Е. co!i MM294, Контроль эа данными трансформантами осуществляется путем ограничительного анализа, позволяющего проверить правильную ориентацию последовательности ДНК человеческого проапо А-! по отношению к последовательности промотора ARG3. Одна из трансформант содержит рекомбинантную плазмиду ро! В9299, которая пригодна для данного условия, Плазмида pui В9299 амплифицируется в Е. coli и используется для трансформации сферопластоя дрожжей
Saccharomyces cerevisiae штамма 10 S44c (рер4 — 3- leu2 — 3, leu2 — 112) (Т. Caiezon u др., см. выше)..
Использование штамма 1с 1697d (АТСС
N 20631) приводит к качественно аналогичным результатам. Затем трансформанты дрожжей подвергаются испытанию на выражение человеческого проапо А-!.
5. Построение ба кте риал ьного вектора секреции, вкл ючаю щего последовать ьность Д Н Кс человеческого про апа ..А=-l:
pNIY1612 (фиг. 6а,б с).
В данном построении последовательность ДНК, кодирующая человеческий проапо А — I, сливается в фазе правильного считывания ниже последовательности ДНК сигнапкного пептида белка OmpA Е. coii.
Для данного эксперимента выбран вектор секреции plN — Ill — ompA — 2 (J. Ghrayeb u др., EMBO 3, 3, 1984 г., стр, 2437-2442). Этот вектор его хозяин Е. coli ТА221 доступны и могут быть получены из "Отдела Биохимии
Государственного Университета Нью-Йорка ", Стоун и Б рук.
Этот вектор секреции несет сильный промотор lpp (липопроте н), фрагмент промотора — оператора lac, последовател ьность
IacIpenpeccopaIacy соответствующие ограничительные точки, расположенные непосредственно после последовательности, кодирующей сигнальный пептид гена ompA, Подходящая рекомбинантная плазмида построена как показано на рисунках 6а, в и с.
Впервую очередь,,вектор секреции pNi — lil — ompA — 2 линейно выравнивается с EcoRI и обрабатывается ДНК полимеразой Т4, Зэтем фрагмент ДНК на 805 pb извлекается из
pul В 9291 путем выравнивания в последовательном порядке с ограничительными ферментами Kpni и SAII, и последующей обработки ДНК полимера-"-й Т4. Этот фрагмент кодирует человеческий проапо А-! и содержит ATG кодон инициирования трансляции. Оба фрагмента, полученные как описано выше, сшиваются друг с другом в равномолярных пропорциях посредством
ДНК лигаэы Т4, и эта сшитая смесь используется для трансформации компетентных клеток штамма JA221 E. со!!, культивированных в среде M9 (J.Н. Мы!!ег нЭксперименты в молекулярной генетике", Cold Spring
Harbor Laboratory СоЫ Spring Harbor НьюЙорк, 1972 г.. с. 431), содержащей 20 мг/л триптофана, 20 мг/л лейцина, 2 г/л лактозы и 50 мг/л ампициллина. Эти трансформанты
1834904
20 отобраны на их стойкость к ампициллину и подвергаются отборочному просеву с 18— мерным синтезированным олиг6нуклеотидом (тот же, что использован в синтезе адаптора, как показано на фиг. 2).
Отобранные трансформанты подвергаются контролю путем ограничительного анализа для проверки правильной ориентации последовательности ДНК проапо А-I относительно последовательности сигнального пептида, носителем которого является вектор секреции (воспроизводимая точка
Есо RI на стыке двух последовательностей).
Одна из трансформант несет рекомбинантную плазмиду, которая отвечает данному условию. Излишняя последовательность, происходящая от построения с адаптером, подчеркнутая в приведенной ниже нуктеотиднрй последовательности:
AGA САТ ТТС TGG 3
Val Ala CIN Ala AIAGIUPhe Met Arg Hls
Phe Тгр устраняется посредством направленного ак — 6 мутагенеза. С этой целью осуществляется синтез нижеследующего 24 — мерного олигонуклеотида: сигнальный пептид--. -праапо А-!
5 GTA GCG GAG GCC AGA САТ ТТС
TGG 3
Val А!а Gln А!а ARg HIs Phe Trp лишенного 12 излишних оснований, и он используется для удаления излишней последовательности из 12 оснований, происходящей от адаптера.
Для осуществления мутагенеза используется система Амершам. Эта система основана на способе F, Есме!и и др. (Nucleic
Acids Res, 13, 1985 г., 8765-8785}. Данный способ обеспечивает высокий выход продукта и наиболее высокую эффективность из числа существующих способов: вплоть до
95 о
В первую очередь, область ДНК, которая предварительно мутагенизирована, клонируется в вектор М13, С этой целью фрагмент ДНК X al — ЦдЦ рекомбинантной плазмиды pIN — 1И вЂ” ompA — 2, несущий ген прозпо А-I, вставляется в вектор MI3mpl9, отсеченный Xbal Н!пбИ. Этот вектор
Ml3mpl9 промышленно доступен; он может быть получен согласно Амершам (8ucklngharnshlre Великобритания). Затем мутагенный 24 — мерный олигонуклеотид гибридиэируется с моноцепочечным матриксом и вытягивается фрагментом Кленова
ДНК полимераэы в присутствии ДНК лигазы
Т4 для получения мутантного гетеродуплекса.
50
Избирательное удаление немутантной нити возможно за счет ввода тионуклеотида в мутантную нить в ходе синтеза в условиях ин витро и за счет расщепления нить МС!1, не подвергнутой фасфоротианатированию.
Такие расщепления дают точки для экзонуклеаэы !!1, которая вываривает нить, не являющуюся мутантом. 8 таком случае нить, являющаяся мутантом, используется как матрикс для перестройки круговой молекулы с двойной нитью, приводящий к образованию монодуплексной мутантной молекулы. Такой мутагенез подтверждается последовательностью соединения между сигнальными пептидом и началом гена проапо А-I. Данная рекомбинантная плазмида
pNIY1612 перестраивается путем сшивки фрагмента Xbal — Hind III в вектора plN — 1!! — оарА-2 с фрагментом Xbal — Ва! 1, который лишен 12 излишних оснований, и с фрагментом Ba! — Hind !!! гена проапо А-1, Эти три фрагмента линейно выравниваются посредством-ДНК лигазы Т4, и данная смесь используется для трансформации компетентных клеток E. со!! TF221, как описано выше. Эти трансформанты отбираются по их стойкости к ампициллину и просеиваются с 18 — мерным олигонуклеотидом, описанным выше. Одна иэ трансформент несет рекомбинантную плазмиду рй!У1612. В данном конечном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид
ornpA предшествует полной последовательности проапо А — I без кодона ATG (фиг, ба, б, с).
Трансформанты Е. co!i затем подвергаются испытанию на выражение человеческого проапо А — !.
6, Лостроение.вектора переноса для ввода последовательности ДНКс человеческого проапо А — I в бакуловирус: pNIY1613 (фиг. 7).
Плазмида pNIY1613, несущая последовательность ДН К человеческого проапо А-1, построена путем расположения сегмента. происходящего от клона pul 89291, ниже промотора гена полигедрина бакуловируса (фиг. 7). В данном эксперименте используется вектор переноса рАсРР6 бакуловируса(3.
Matsnura и др.. J. Gen, V!roI 67. 1986 r., с
1515-1529); он может быть получен из "Отделения микробиологии и иммунологии" Оттавского университета. Данная плаэмида несет проь;отор гена полигедрина вплоть до нуклеотида — 7 в ведущей последовательности в положении 5 ; в ней отсутствует ATG кодон полигедрина и 170 первых нуклеотидов последовательности, кодирующей полигедрин., Желаемая точка BamHI
1834904
55 расположена ниже нуклеотида -- 7, Построение, иллюстрированное на фиг. 7. осуществляется следующим образом. ДН К плазмиды pAcRP6 линейно выравнивается посредством BamHi. Кроме того, фрагмент
ДНК на 810 pb извлекается из pui 89291 путем выравнивания с ограничительными ферментами ASp 718 и SAII. Данный фрагмент кодирует человеческий проапо А-I u содержит кодон ATG инициирования трансляции. Эти два фрагмента в равномолярных пропорциях совместно обрабатываются
ДНК полимеразой Т4, сшиваются посредством ДНК лигазы Т4 и используются для трансформации компетентных клеток штамма AR58 Е. coll, Данные трансформанты отбираются на их стойкость к ампициллину, просеиваются посредг-вом 35 — мерного синтезированного олигонуклеотида, меченого 32р (сматри рис. 2), соответствующего части ДНК последовательности проапо А — 1, и осуществляется их контроль путем ограничительного анализа для проверки правильной ориентации данной последовательности ДНК проапо А--1 относительно промотора гена полигедрина. Одна из трансформант несет рекомбинантную плазмиду. pNIY1613, которая отвечает данному условию; она используется в анализе данного выражения.
7. Продуцирование человеческого проапо А-1 трансформированными микроорганизмами
Культуры, состоящ е из 20 мл штамма
AR58 или 3М101 Е. coil, трансформирован-. ные соответственно pui В9291 и pUL S9296, культивируются в обогащенной среде, дополненной 50-ю мкгlмл ампициллина (культурный бульон LB, смотри Т. Maniatis и др., приведено выше, для проведения экспериментов) до тех пор, пока не достигается оптическая плотность от 0,6 до 630 нм. В случае pul B9291 индукция.промотора лямбда PL осуществляется с созданием исходных условий роста культуры от 30 С до 42 С, таким образом, что происходит инактивация подавителя проматора лямбда Pi (M.
Rorenberg и др.. Methods Enzymoi 101, 1983
r.. стр, 123 138. Индукция,происходит в течение 20 минут.
В случае pul B9296 индукция промотора 1ас осуществляется с вводом в культуру, инкубированную при 37 С, химического индуктора IPTG (изспропил-бета-0-тиагалэктозид) до тех пор. пока не достигается конечная концентрация 1 мМол (R.
Lorenzetti и др., приведена выше), Индукция происходит в течение 60 минут.
С другой стороны, культуры, состоящие из 20 мл дрожжевых клеток 10S44c. трансформированных pui В9299, культивируются при 30 С в среде азотированного основания для дрожжей(0_#_со), дополненных глюкозой (1ь), до тех пор, пока не достигается оптическая плотность 0,3 — 630 нм. Нет необходимости ни в одном индукторе, поскольку в данном конкретном случае данное выражение является основным.
Отбираются образцы из 1 мл указанных выше культур и центрифугируются при
15.000 g в течение 5 мин. Полученные осадки лизируются в кипящем додецилсульфате натрия (DSS}. Эти скопления переводятся в суспензию в 50 мкл буфера, содержащего
DSS, (50 мМол Трис-HCI, рН = 6.8, 2;ь 0SS, 6 Мол, мочевины, 5 2-меркаптоэтанола и
10 глицерина) и данная суспензия нагревается при кипении в течение 3 мин при
100 С. Затем экстракты центрифугируются при 15.000 g в течение 10 мин. Эти образцы готовы, таким образом, для анализа путем электрофореза на палиакриламидных гелях концентрацией 15 (, или 7,5ь в присутствии
DSS, в денатурированных условиях U,К.
Laemmli, указано выше).
После электрофореза полиакриламидные гели быстро промываются 40 миллилитрами дистилляционной воды и 40 миллилитрами буферного раствора фосфата натрия (50 м Мол) с величиной рН 7,5. Затем эти белки электрически переносятся с гелей на нитроцеллюлозный лист в течение двух часов при 60 Вольтах и 1 5 Амперах в том же буферном растворе фосфата (Т, Cabeezon u др„см. выше). Нитроцеллюлозные листы насыщаются альбумином (1 ) в 50 мМол буферного раствора фосфата натрия с величиной рН = 7,5, затем они инкубируются при комнатной температуре в течение ночи и в присутствии сыворотки кроличьего античеловеческого апо А — I при разбавлении 1/500 (и в случае pul В9296 в присутствии моноклональных антител анти-бета-галактозидазы мыши) в том же буферном растворе, лишенном ал ьбумина.
Данные листы пятикратно промываются 40 миллилитрами того же фосфатного буферного раствора и затем инкубируются в
40 мл фосфатного буферного. раствора, содержащего 10 мкг/мл сыворотки козьего анти-антитела кролика (или анти-антитела мыши) и подвергаются мечению в пероксидазе, После четырех часов инкубирования при комнатной температуре данные листы снова пя икратно промыва отся в 40 мл фосфатного буферного раствора и окончательна проявляют ч путем ввода 50 мл раствора
1834904 хромогенного субстрата (10 мг диаминобензидина. 100 мкл перекиси мочевины концентрацией 10 (, .и 100 мМол Трис-НО с величиной рН 7,6), В случае pul В9291 и pul
В9299 обнаруживается уникальный продукт, реагирующий с антителами анти-человеческого апо А — l. Этот продукт имеет молекулярный вес, соответствующий молекулярному весу эталонного естественного апо А-I. В случае pul В9296 обнаруживается слитый полипептид размером, предусмотренным для суммы бета-галактозидазы полипептидов и проапо А-1 (144 кДа), реагирующий с сывороткой человеческого анти- апо A-1 и с сывороткой анти-бета-галактозидазы, Эти размеры определены предварительно с помощью калибровочной кривой, основанной на миграци эталонов молекулярного веса, находящихся на тех же гелях, что и клеточные экстракты.
В другом эксперименте культуры 20 мл слоя JA221 Е. соИ трансформированные
pNIY1612, культивируются в обогащенной среде, дополненной 50 мкг/мл ампициллина (питательный бульон 1 В, смотри Т.
Man1atls и др., указано выше) до тех пор, пока не достигается оптическая плотность, равная от 0,6 до 630 нм. Индукции промотора 1ас осуществляется путем ввода в культуру, инкубированную при 37 С, химического индуктора IPTG {изопропил-бета-0-тиогалактоэид) до тех пор, пока конечная концентрация не будет равна 2 мМбл. Индукция
- осуществляется в течение 60 минут, Отбираются образцы этих культур в количестве 1 мл и осуществляется центрифугирование при
15000 g в течение 5 мин. Полученные осадки собираются посредством небольшого оемотического воздействия с целью освобождения периплазмовой фракции (D. КозЫапб и
О. Botstel, Cell, 20, 1980 r, 749-760). Освобожденная фракция переходит в суспензию в буферном растворе образца, содержащем
DSS, упомянутый выше, но не содержащем мочевины, суспензия доводится до кипения, центрифугируется и подвергается электрофорезу на полиакриламидном геле концентрацией 12,5$ а присутствии DSS c последующим иммунодетектированием после электрофоретического переноса. Фракция синтезированного проапо А-l обнаруживается в данной клетке. но не в периплазме. Это обусловлено либо тем фактом, что проапо А-1 не секретируется, либо тем фактом, что эффективность осмотического воздействия не является оптимальной. Основная фракция проапо А-I обнаруживается в свободном состоянии в данной среде после осмотического воздей25 переноса и способом электрофореза на полиакриламидном геле концентрацией
12,5 (в присутствии DSS, после лизирования клеток посредством буферного раствора ЯРА (0,05 Мол буферный раствор
Трис-НО, рН - 7,2, содержащий 0,15 Мол
NaCI, 1 Тритон Х100, 0,1 j, DSS, 0,1О(, деэоксихолята натрия и 1 мМол фтористого фенилметилсульфонила, FPMS), и обработки кипящим DSS. Был обнаружен один единственный продукт, реагирующий с антителами анти-человеческого апо А-I. Он имеет молекулярный вес, соответствующий молекулярному весу этанвла естественного апо А-I, и этот выраженный белок является основным составляющим компонентом общих белков. Концентрация проапо А-I на 1 л культуры, измеренная путем простой радиальной иммунодиффузии (6, Mansln) и др., lmmunochem, 2, 1965 г.,235-254) составляет примерно 100 мг
9. Цитоплазматическое продуцироваwe человеческого проапо А-I в Е. со11
Использование определенной минимальной среды
Для цитоплазматического продуцирования человеческого проапо А — 1 посредством Е, со11 в минимальной среде использовалась плазмида ро! В9292. Плазмида рв1 В9292 была построена путем обмена фрагмента Есой! — Йсо(плазмиды pui
В9291, кодирующей промотор лямбда Р, с ere x 101. 1983 r., стр. 1.23 — 138). Этот фрагмент ствия, указывая таким образом на то, что белок хорошо секретирован клетками. 8, Продуцирование человеческого проапо А-1 клетками насекомых, зараженных бакуловирусом Рекомбинантная плазмида рй1У1613 используется совместно с диким штаммом бакуловируса для совместного заражения клеток Spodoptora frugiperda в культуре, Выборка рекомбинантных вирусов. лишеннных полигедрина, дала в результате рекобинантные колонии, Рекомбинантный вирус, очищенный от колонии, используется для заражения клеток насекомых, Эта про15 цедура хорошо известна для специалистов в данной области и подробно описана M,D. Summer u G.Å. Snith "Справочное руководство по методам для бакуловирусных векторов и операциям для клеточных культур насекомых", Техасский Университет. Колледж Стэйшн, 1987 r. Этот рекомбинантный вирус испытан на продуцирование проапо А-1 иммунологическим способом после электрофоретического 1834904 EcoRi — Ncol вектора POTS (G. Sevare и др., Cell, 36, 1984 г, с. 43-49) содержит также эффективный и регулируемый промотар Р, фага лямбда. Он выращивается в определенной минимальной среде культур 20 мл штамма AR58 Е. coll, трансформированного плазмидой pul B9292. Состав минимальной среды (на литр) следующий: 3 r NazHP04 2Н20, 3 г. КН2РО4, 0,5 r йаС1. 1 г NH4CI, 1.37 мМол MgSO4 7НгО, 29,5 мкМол, FeCIs 6H20, 236 мкМол MnSO4 Hz0, 10 г глюкозы, 1 мг витамина Â1, 50 мг ампициллина, питательный бульон культуры LB 1/20 (об/об), Клетки культивируются в данной минимальной среде до тех пор, пока оптическая плотность не достигает значения от 0,5 до 630 нм. Индукция проматора лямбда Р осуществляется путем поддержания начальных условий роста культуры от 30 до 42 С так, чтобы инактивировать подавитель промотора лямбда Рг (М. Rosenberg и др., указано выше). Индукция осуществляется s течение 60 минут. Отбираются образцы культуры в количестве 1 мл и их пропускают в пресс Френча или центрифугируют при 15000 g в течение 5 мин. Полученный общий клеточный экстракт или осадок подвергаются обработке DSS при кипении, как описано в разделе 7. После электрофореза и электрофоретического переноса обнаруживается один единственный продукт, который реагирует с антителами — анти-человеческой Апо А-I. Молекулярный вес этого продукта соответствует молекулярному весу эталонного естественного апо А-I. Концентрация выраженного проаполипопротеина А-I e определенной минимальной среде составляет 13,5% общих белков, либо установленная концентрация проапо А-I составляет примерно 270 мг на литр культуры. 10. Изеоечение. очисткз и кебзктериеельн. цируемд.га» т анс о мирсванными мик оо ганизмами 10.1, Извлечение и очистка. Осуществляют центрифугирование сырых экстрактов рекомбинантного проапо А— l при 4.000 g в течение 15 мин, и осадок извлекают. Поверхностный слой центрифугируют при 100 000 g в течение двух часов. Полученный осадок переводят в суспензию в минимальном объеме буферного раствора (TEN100), содержащего 20 мМол. Трис-НСI, рН = 7,5; 1 мМол этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕДТА), 100 мУол NaCI; 1,75 мкг/мл FPMS и 100 мкг/мл мертиолат натрия (натриевая соль э гилртуть-тиосалицииловой кислоты), и укаэанные объемы суспензии и всплавшего слоя отдельно друг 10 тивности, соответствующую человеческому апо А — I. Полученная таким образом каждая фракция далее очищается методом хроматографии в колонке с Sephacryl S200, с ис15. пользованием того же буферного раствора 25 5S ат друга доводятся до начального объема экстракта посредством того же буферного раствора. Затем белок осаждается из обеих суспензий при увеличивающихся концентрациях изопропилового спирта. Методом радиальной иммунодиффузии (G, Manelnl u др„указана выше), используя промышленный эталой апо А-1, определяют фракцию осажденного белка каждой суспензии, которая составляет основную часть иммунореакв качестве элюента. Собирают фракции объемом 0,9 мл, и методом радиальной иммунодиффузии в каждой фракции определяют количество общего белка, имеющего иммунореактивность, соответствующую иммунореактивности апо А-1. Молекулярный вес белка, элюированного в данных фракциях, определяется путем калибровки колонки с помощью эталонов с известным молекулярным весом, таких как альдолаза, альбумин бычьей сыворотки, яичный альбумин, химот- . рипсиноген и цитахром С, s идентичных условиях. Чистота проапа А-l на мг общего белка в основных фракциях, содержащих рекомбинантный проапо А-I, выраженная в мг белка, ймеющего ту же иммунореактивность, что и промышленный эталон апо А — 1, составляет 95%. ккткекки 10.2.1. Физические сеоистес Оекомбина нтногопроапа.Ь1 При центрифугировании при 100 000 g рекомбинантного проапо А-I, очищенного и изолированного от поверхностного слоя и осадка, а изоэлектрической фокализацией согласно способу М. Catslmpoolas (Апэ1. Biochem, 26, 1969 r., стр. 54 — 62) и с применением аутогенерированного градиента с величиной рН от 4 до 6, получается одна единственная полоса с изоэлектрической точкой 4,95. Плазматический апо А — l является немного более кислотным и имеет изоэлектрическую точку 4,75. Это различие в величине рН равное 0,2 между изоэлектрическими точками рекомбинантного апо А-I и плазматического апо А-! очень близко по значению уже известному различию между изоэлектрическими точками плазматического апо А-i, которое. как уже сообщалось ранее, равно 0,17 (6Л, МШэ и др., Lab. Tech. Biochem, Mol. Е lol, 14, 1984 r., стр. 244 — 245). Ч ro касается молекулярного веса. то рекомбинантные проапо А-l осадка и поверхностного слоя оба состоят из одной 1834904 единственной полипептидной цепи идентичного молекулярного веса равного 29.9+ +1,4 кДа. Человеческий плазматический апо А-l имеет несколько меньшую длину цепи и его молекулярный вес равен 29,3 +1,3 кДа. 10.2.2. Оо ле е лелтидиое корту м 6. .пыжов ю Йуоросквтоле, Осуществллетсл химическое ресщеллеwe посредством 3-бром-3-метил-2-t(2-нитрофенил)тио)-3 Н-и идола (В NP S.ñкатол а) согласно способу А. Fontana (9lethods Емуво1 25, 1972 r, с. 419-423). 5-10 мкг очищенных белковых препаратов растворяют в 100 мкл раствора фенола (0,15 o6/об $), в водном растворе 50 (об/об) уксусной кислоты. Затем добавляют 50 мкл раствора 4,8 мг BNPS-скатола на мл ледяной уксусной кислоты и инкубируют при 25 С в течение 72 ч. Затем добавляют 50 мкл 2-меркаптозтанола и инкубируют второй раз в течение пяти часов при 37 С. Образцы выпариваются, снова растворяются в 100 мкл воды и трехкратно экстрагируются 200ми мкл зтилацетата. Органически фазы удаляются и водные фазы лиофилизируются и анализируются путем злектрофореза на полиакриламидной rene — DSS. 8 случае химического расщепления BNPS-скатолом, число и размер фрагментов, полученных от апо А-I, могут быть в той или иной степени предсказанными, если принять во внимание, что в используемых экспериментальных условиях BNPS-скатал избирательно отсекается после триптофановой группы, Приняв эффективность в каждой точке расщепления за 100, наибольший фрагмент, который может быть получен, это С-терминальный фрагмент молекулярным весом 15,4 кДа. Молекулярные веса остальных фрагментов находится в интервале ot 0,5 до 5,3 кДа, и ввиду этого они 5 слишком малы для их обнаружения, В случае неполного расщепления фрагмент 15 4 кДа будет "вытянутым" в направлении N-терминального конца, образующего соответственно фрагменты 10 молекулярными весами 20,7 кДа, 23,1 кДа, 27,6 кДа. Такие предложения вполне реальны для человеческого плазматического апо А-l, так же как для других очищенных препаратов рекомбинантной проапо А-1. 15 Формула изобретения Способ получения последовательности ДНК, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин А-1, предусматривающий получение клонов ДН К пу20 тем клонирования фрагмента ДНК в pBR 322, выбор клона, кодирующего препроаполипопротеин А-I, выделение последовательности ДНК из выбранного клона, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью обеспечения 25 наилучшей экспрессии человеческого проаполипопротеина А-l. клонируют фрагмент кДНК, полученный путем лигировэния Ball — Pstl фрагмента последовательности ДНК, кодирующей аминокислоты +15 — +243 про30 аполипопротеина А-l, с синтетическим фрагментом со следующей последовательностью ДНК:. 5 — АТО AGA САТ TTCTGGCAGGAGGACG ААССТССАСААТСТ CCTTGGGATAGAGTTA AGGACTTG — 3, ко35 дйрующей аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающей кодон инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот -6, -1, +1, +3, +4. +5, +6, +7, +10, +11 и +14. ° В В Е ИФА1ФАТ МЩРй а 1834904 l0 3) 30 . Ф 50 И я) ЗЫУИООПАКА! А ИИКВИКУКУВАОЗО йКААVLf LAVLF LyбЬОЯВК ЮЯ -Ю 3N УО 1Ю Ю KG 210 2 9 . 230 ООВУИВООИАЗО Я ЫУОВАООВВВЖПВУАВИОИИОКО ИУО KDS6R9YV 3 QF ESS AL6K0L HKKLLD 30 Ю 3Q 30 2Ю РО Ж1 2X) 3Е 310 КОВВИЫИО(РЮВАИИААВЗБОИУУИООИ(УУВАПВВИЗКО Я КВВУТ S7 F S KLRKQL6P VT OKFМВМ1 50 Ю 70 Х9 330 М %0 38) 370 380 3% ВВРЮСО 6 E КЕТЕ6<РОЕИSKВLЕЕV КЯKVОРYL ® Ж 39 МЮ C) CD 60 Мб 450 ЙЮ Ю0 ЯУКВВВВВОРИУЮИ ИАВОВООЮНООВООВВВАВУВКУАКВУО 39РЯККМОЕЕИЕLYВОKVFP LRЯELЯ ИО g 320 Фйа f ® .О AD DO 120 13 Ю m ЧПОИКИ ОУКИОИАНООИОУОУКУАОО КОЯОКООЮИС F М999ЕPPOSPN9RYKDLA 1 VYV9VL 1 10 я) 1834904 00 60 90 06 90 0I6KK E66IIЕKLKEL9KKL69L6EEI!II9L9I 66 И) бИ 65 Ю EO 7а 7ю IIKK096I ILllIKEIK0900E960K LKEtl66ARLAE fHAKA7EHLS TESEK И) Z0 ЕЮ 7m Ж Ю Ю 7в Ж ЮИ ЯП7ОИЖТЙХТЕСЕИЮ дppgLEBLRP6LLPYLES F KVSFLSA 2Ю Z9 2% мю m ю 8Ю ОО За зж -. av ОИИЯЖЖТВ6ИЦ шюю ака ЕEE УТ КК1879 26 а@ 18-0690 †.ф5 0 9 !@=nary ээ тстачааНХЯСаССЮСПЮЫВ ПгаКЛаХСИтс ааПССтСДКС phd Trp С3д СМелгр Gln Pro Pm Gin Ger Гго Trp hnp Arg tLIal Ьув Мр le> Alla) 3 1 Ч1 +3 16 +g +и +иа 1 1 В г, роидптид Зралцд ац A- (аа,-aarv) (да б аа I PIay Рц ИЬ gH>-Ve PILI II anlK IfIKIH M8TMOHMH de cliIKao точка рао цеплания пГ птилдэ1 A-l @иг 2 ТП9996900 d Риг.f точка БсЕ7 5 < —— re 3 5 — 30099 — 9 ОЦ6 АГА AT TTt: T% Уб С% 9 6С 9N СО СО С М TG ССТ T% ЖТ N бП АА5 С4С Т5 5 1834904 Рзт йсо1 стоп ;репроьпо А-1 синтезирован (иет ÀÀ Рзт1 ВмЛ Нс01 ВмЛ ATG Ьа1 проапо А-1 Мсо1 ВА11 1834904 SaLI аиЮ КР 1 дроаио А- 0н1 805Рв сшивка Ьц.1 проапо А-I TG B HI АмРА Вди81 т4яяК пс и р эа ЗЫ Т4 ЛНК полимераза SacI 1 открытык SALI HI О==::П пр 4- ткрытый цитоi ATG стао 1834904 лиНЗ АирА аР 718 ровпо А- Sad открытыЯ цикл 810рв А76 проапо А-I стоп ВдиНЗ Т4ДН полимераза; Ass 718,SaQ Т4®К полимераза QTKpbtTHR J (от@)ытыф проц ЦИКЛ ЗТОР 1834904 роало А-Х стол $к1 роапо A-1 топ и 1 ал амром сои (A«po a8 ?+ "" Проапо А-I 1834994 )4ia1 Bali MDl l l Q ОРОдачи сигнал оюрА проеио Л-? 1834904 топ роапо АЦ Составитель Н.Кузенкова Техред М.Моргентал ° Корректор M.Керецман Редактор Заказ 2705 Тираж Подписное 8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, yn,Гагарина, 101 Ase718 Ьц.! v71S TG проапо А-1 стоп Вм.!
