Способ подавления фаголизиса при культивировании микроорганизмов

 

Использование: микробиологическая промышленность, культивирование микроорганизмов , подавление фаголизиса при культивировании микроорганизма. Сущность изобретения: в процессе культивирования микроорганизмов вводят в культуральную среду ингибитор фаголизиса , в качестве которого используют хитозан или его производные, предпочтительно в конечной концентрации не более 0,01 мас.%. 8 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 1/00, 7/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) -1-1»А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ Ф

В

1 (21) 4955352/13 (22) 28.06,91 (46) 30.08.93. Бюл, ¹ 32 (76) И.Г. Атабеков, 3.М. Кочкина, Г. Поспешны и С,Н. Чирков (56) Авторское свидетельство СССР

¹1439121,,кл. С 12 N 1/00, 1988, Патент Франции ¹ 2242462, кл. С 12 В 1/24, 1976.

Авторское свидетельство СССР

N. 697562, кл. С 12 N 1/00, 1979.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу подавления фаголиэиса при культивировании микроорганизмов, находящему применение для защиты культур микроорганизмов от фаголизиса при промышленном культивировании.

Цель изобретения — повышение эффективности подавления фаголиэиса, расширение спектра действия ингибитора и снижение его токсичности.

Поставленная цель достигается тем, что в способе подавления фаголизиса при культивировании микроорганизмов путем введения в культуральную среду ингибитора фаголизиса, согласно изобретению, в качестве ингибитора фаголизиса используют хитоэан или его производные. Для более эффективного подавления фаголизиса целесообразно вводить хитозан или его производные в культуральную среду в конечной концентрации не более 0,01 мас.%.

Для удобства применения в качестве производных хитозана используют соль ор„„5U „„1838402 А3 (54) СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ФАГОЛИЗИСА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Использование: микробиологическая промышленность, культивирование микроорганизмов, подавление фаголиэиса при культивировании микрооргвнизма, Сущность изобретения: в процессе культивирования микроорганизмов вводят в культуральную среду ингибитор фаголизиса, в качестве которого используют хитоэан или его производные, предпочтительно в конечной концентрации не более 0,01 мас,%.

8 табл. ганической или неорганической кислоты хитоэана или смесь солей. В качестве соли органической или неорганической кислоты хитозана предпочтительно используют ацетат хитозана или гидрохлорид хитозана, или их смесь.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В культуральную среду, применяемую для культивирования микроорганизмов, вносят ингибитор фаголизиса — хитозан или производные хитозана, предпочтительно в конечной концентрации не более 0,01%.

Может быть использован хитозан различной молекулярной массы и степени деацетилирования. В качестве производных хитозана применяют соли органических кислот хитоэана (соли уксусной, молочной кислоты и других) или соли неорганических кислот хитоэана, например гидрохлорид хитозана, или смесь солей, Хитозан или производные хитозана вводят в культуральную среду. Процесс культивирования микроорганизмов осуществляют по известной мето1830402 дика. Для лучшего понимания настоящего изобретения приводятся следующие примеры осуществления заявляемого способа.

Пример 1. Влияние хитозана ))а инфекцию Escherlchia coli штамма Bl фагом Т7.

Ночную культуру Escherichia coll штамма В в объеме 2 мл на среде LD вносят в 50 мл среды М9, Состав среды М9 следующий;

А)лмо) ий хлористый 1,0г

Магний сернокислый 0,13 r

Калий фосфорнокислый двузамещенный 3,0г

Натрий фосфорнокислый одноэамещенный 6,0 г

Глюкоза 4,0г

Вода 1,0л р i 6,0

Клетки выращивают на качалке при 200 об/мин и те)лпературе 37 С в течение 2 ч до концентрации 5 10 клеток в 1 мл.

Хитоэан растворяют в подкисле)п)ой дистиллированной ваде до ко))ечной конце )трации его 0,1 мас.%, после чего рН полученного раствора доводят до 6,0.

К суспанзии клеток добавляют хитозан до ко))ечной концентрации 0,001 или 0,01 мас.% и инкубируют 20 мин, посла чего вводят фаг Т7 с множественностью инфекции

0,05. Смесь инкубируют до ))аступления лизиса в контрольной пробе (без добавления

x«1osa)Ia). Нсе пробы центрифугиру)от для

ocE oáoæäeíèÿ от остатков нелизированных

vi)cToK. Наличие инфекционного фага выявляют в супернатанте каждой пробы )летодом атаровых слоев по Грзция. Результаты испытаний представлены и табл. 1.

Пример 2. Влияние ацетата хитозана на и )фекцию Eschc:Iichia coli шта)л)ла Hl фатом Т7.

Процесс проводят аналогично описанному в примере 1. Ацетат хитоза)га растворяют в дистиллированной ваде и вводят в культуральную среду до конечной концентрации О, 001 или 0,01 мас.,4.

Результаты испытаний представлены в табл. 2.

П р и )л е р 3, Влияние смеси солей

I идрохлорида L1 ацетата хитозана на инфекциo E cherlchia соИ штамма Hl фагом Т2, Процесс проводят аналогично описанному в примере 1. Хитбзан растворяют в смеси разбавленных соляной и уксусной кислот, взятых в соотношении 1:1 до конечной концентрации его 0,1 мас.%, затем рН полученного раствора доводят до 7,0. Выпавший осадок смеси солей гидрохлорида и ацетата хитозана отделяют и растворяют в дистиллированной воде. Полученный водный раствор солей добавляют к суспензии

35 ному в при)лере 5.

Результаты испытаний представлены в табл. 6.

Пример 1. Влияние ацетата хитозана

)la инфекцию B acillu в тхаг) и 9 ) епв) в

subspecies gaIleriae l-97 фагом l-978, Процесс проводят аналогично описанному в.примере 5, Результаты испытаний представлены в табл. 7.

Пример 0, Подавление хитозаном инфекции при спонта)п)ой индукции фага в культуре Bacillus thurlngiensis subspecies цаИепае 1-97.

l-io«I-)y)o культуру Haciilus thuringiensis

subspecies galleriae l-97 в объеме 2 мл на среде LB вносят в 40 мл среды М9. Клетки выращива)от на качалке при 200 об/мин и температуре 30 С в течение 4 ч. В опытные пробы вносят хитозан до конечной концентрации 0,001 и 0,01 j, и инкубируют в течение 2 сут. Затем все пробы центрифугируют для осаждения клеток бацилл. Супернатант анализируют на присутствие инфекционного фага, как описано в примере 5. клеток до конечной концентрации 0,001 или

0,01 мас. $.

Результаты испытаний представлены в табл. 3.

Пример 4, Влияние хитозана на инфекцию Escherichla coll штамма Bi фагом

Т2.

Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, Результаты испытаний представлены в табл. 4, Пример 5. Влия))ие гидрохларида хитозана на инфекцию Bacillus ihuringiensis

subspecies galleriae 1-97 фатом 1-97А, Ночную культуру Bacillus shuringiensls

"5. subspecies gaileriae 1-97 в объеме 2 мл на среде LB вносят в 40 мл среды fv19. Клетки выращивают на качалке при 200 об/мин и температура 30 С а течение 4 ч, Б суспензи)о клеток добавляют гидрохлорид хитоэа20 на в виде его раствора в дистиллированной воде до коне гной концентрации 0,001 или

0,01 мас,% и инкубируют 20 мин, после чего вводят фаг 1-97А с множественностью инфекции 0,05. С)лесь инкубируют а течение

Г

16 ч, Затем все пробы центрифугируют для освобождения от остатков lief))1311poBa) IIII lx клеток, Наличие инфекционного фага в супернатанте каждой из проб выявляют метода)л атаровых слоев по Грация. Результаты испыпга) ий представлены в табл. 5, Пример 6. Влияние хитозана Ila инфекц ио Bacillus tllullnglensls subspecies

9аИeriae i-97 фатом l-97А.

Процесс проводят аналогично описан1838402

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Результаты испытаний представлены в табл. 8, Предлагаемый способ по сравнению с известными способами позволяет повысить эффективность подавления фаголизиса при культивировании микроорганизмов.

Согласно предлагаемому способу используют ингибитор фаголизиса-хитозан B концентрации, в 10 раз меньшей (не более

0.01о ) при множественности инфекции в

500 раз большей (0,05) по сравнению с прототипом, в котором концентрация гексаметилендиизоцианата составляет 0,1, множественность инфекции 0,0001, При этом способ обеспечивает подавление инфекции на 95,5-100 g,, Установлено, что хитозан и его производные эффективно подавляют лизис грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, вызываемый как экзогенными, так и эндогенными фагами, не оказывая при этом отрицательного воздействия на развитие культивируемых микроорганизмов и свойства культуральной среды. Способ характеризуется экологической безвредностью в связи с нетоксичностью хитозана и его производных и их способностью к полной биодеградации.

Использование предлагаемого способа позволяет устранить фаголизис при промышленном культивировании микроорганизмов.

Формула изобретения

1. Способ подавления фаголизиса при культивировании микроорганизмов путем

70 введения в культуральную жидкость ингибитора фаголиэиса, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса, расширения спектра действия ингибитора и снижения его токсичности, в

15 качестве ингибитора используют хитозан или его производные, 2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи и с я тем, что хитозан или его производные вводят в культуральную среду до концентрации

20 не более 0.01 мас. Д.

3. Способ по пп. 1-2, о т л и «а ю щ и йс я тем, что а качестве производных хитозанэ используют соль органической или неорганической кислоты или их GMBcb, 25 4,Способпоп.3,отличающийся тем, что-в качестве соли органической кислоты используют ацетат хитозана, а неоргани BcKoA — гидрохлорид хитозана, 1838402

Таблица 4

Таблица 5

Табл.ицаб

Таблица 7

Таблица 8

Составитель И. Атабеков

Редактор Т, Горячева Техред М, Моргентал Корректор Т. Вашкович

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина. 101