Способ получения пероральной химической вакцины

 

Изобретение относится к медицине, а именно к специфической профилактике инфекционных болезней, например холеры и колибактериоза. В предлагаемом изобретении разработан промышленный способ изготовления химической оральной вакцины, содержащей анатоксин холероген и 0-антиген, таблетированной с ацидорезистентным покрытием. Данный способ отличается от известных раздельным получением анатоксина холерогена и соматического 0-антигена, что повышает стандартность целевого продукта, увеличивает выход препарата путем использования штаммов-гиперпродуцентов антигенов и упрощает технологию процесса. Это достигается последовательным фракционным выделением сульфатом аммония на обеззараженной формальдегидом культуральной жидкости гипертоксигенных, полученных методом генной инженерии штаммов холерного вибриона соматического 0-антигена между 0,2 - 0,35 насыщения и анатоксина холерогена между 0,35 - 0,80 насыщения. Раздельное получение полуфабрикатов анатоксина холерогена и 0-антигена позволяет сконструировать стандартный целевой продукт - таблетки вакцины содержат 100000 ЕС анатоксина и по 1000 условных единиц 0-антигенов обоих сероваров. Использование гипертоксигенных штаммов холерного вибриона повышает выход препарата в 4 - 5 раз. Упрощение технологии достигается раздельной стерилизацией и лиофилизацией анатоксина и 0-антигена. Конструирование таблеток облегчается путем добавления точного количества каждого антигена к наполнителю таблетки. 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, точнее к специфической профилактике инфекционных болезней, а именно холеры и колибактериоза.

Положение в мире по заболеваемости холерой признано ВОЗ критическим, так как количество охваченных ею стран (около сорока), массовость, высокая летальность и быстрота распространения в настоящее время превышают имевшее место в 1971 г. во время текущей пандемии. В связи с этим в меморандуме ВОЗ, основанном на работах и мнении специалистов из 14 стран, было заявлено о необходимости специфической профилактики путем конструирования оральных вакцин против холеры. Парантеральные холерные вакцины признаны недостаточно эффективными, а массовое их применение затруднено из-за опасности заражения СПИДом.

Из существующих оральных вакцин против холеры наиболее изучены две химические вакцины. Одна из них (комбинированная), состоящая из убитых клеток холерного вибриона и субъединицы В его токсина, была испытана в Бангладеш и показала свою перспективность в основном при иммунизации детей старше 5 лет эффективность составляла 68 у остальных 52% Эта же вакцина создавала перекрестный иммунитет против заболеваний, вызванных токсигенной Е. соli (Вlack et al 1987, Сlemens et al 1987, 1988, Ноlmgren et al 1990). Однако дальнейшего применения вакцины как коммерческого препарата не наступило, по-видимому, из-за не высокой эффективности и высокой стоимости (Gennes C. 1991).

Второй препарат химической вакцины, разработанный во ВНИПЧИ "Микроб" (г. Саратов), состоит из двух частей: анатоксина холерогена вместе с 0-антигеном серовара Инаба (основное авт. свид. N 102735, 1977) и 0-антигена Огава (дополнительное авт. свид. N 316674, 1990). Вакцина успешно испытана в контролируемых опытах на волонтерах, наблюдалась перекрестная защита против кишечных заболеваний (Сумароков А. А. и соавт. 1990), утвержден экспериментально-производственный регламент.

Из живых оральных вакцин против холеры наиболее изучены мутант СND 103 HgR из патогенного штамма 569В и бактериальный гибрид холерного вибриона и S. typhi Тy21а, в экспериментах они показали слабый эффект, но работа продолжается (Levine et al, 1989, Forrest et al, 1989).

Помимо оральной холерной вакцины для профилактики этой болезни, ВОЗ сделаны рекомендации изучить возможность применения ее для профилактики заболеваний, широко встречающихся в мире, вызванных энтеротоксигенной кишечной палочкой. Выше было указано, что при испытаниях холерных химических вакцин наблюдают создание у людей перекрестного иммунитета и колибактериозам. Экспериментальные же доказательства антигенного, структурно-химического, функционального подобия энтеротоксинов холерного вибриона и кишечной палочки весьма многочисленны (Езепчук Ю. В. 1987).

В качестве прототипа взято изобретение (авт. св. N 102735), в котором описан способ совместного выделения обезвреженного формальдегидом анатоксина холерогена и соматического 0-антигена из куртуральной жидкости штамма 569В холерного вибриона серовара Инаба путем осаждения сульфатом аммония между 0,2 0,8 насыщения. Материал после диализа разводят до полного растворения (в среднем до 60 л с одного реактора), подвергают стерилизирующей фильтрации и лиофильно высушивают. В сухом полуфабрикате определяют количество анатоксина и 0-антигена Инаба в 1 мг и конструируют таблетки. В одной таблетке должно содержаться 100000 120000 ЕС анатоксина и не менее 1000 усл. единиц (обратный титр РПГА) 0-антигена Инаба.

Недостатком известного способа, связанного с одновременным совместным выделением из культуральной жидкости двух основных иммуногенов, является получение на конечном этапе ограничено стандартной рецептуры целевого продукта, в которой точно обусловлено содержание в таблетке только анатоксина холерогена, тогда как для 0-антигена указывается лишь наименьшее его количество (ВФС N 42269ВС 90. Утверждена 6.12.90 зам. министра здравоохранения). Полной корреляции в интенсивности продукции двух иммуногенов у штаммов холерного вибриона (особенно гипертоксигенных) отмечено не было, т. е. увеличение одного не сопровождалось таковым другого, поэтому содержание их в полуфабрикате подвергалось определенным колебаниям (Джапаридзе с соавт. 1991), что приводило к ограничению стандартности целевого продукта по 0-антигену.

Недостатком известного способа является невозможность использования его для получения препарата из штаммов гиперпродуцентов холерогена, например полученных с помощью генной инженерии, при культивировании которых высокая продукция токсина не сопровождается увеличением концентрации 0-антигена, что ограничивает выбор продуцента и возможность повышения выхода целевого продукта.

Недостатком известного способа является также предложение совместного выделения термолабильного растворимого белка анатоксина и тормостабильного малорастворимого полисахарида 0-антигена. Совместное выделение антигенов со столь разными свойствами увеличивает трудоемкость технологии, затратность времени и средств, особенно на стадиях стерилизации и лиофильного высушивания (обрабатывается 60 л материала с одного реактора) и конструирования рецептуры таблетки.

В изобретении разработан промышленный способ раздельного получения анатоксина холерогена и соматического 0-антигена холерного вибриона, повышающий стандартность целевого продукта, увеличивающий выход препарата путем использования различных штаммов гиперпродуцентов антигенов и упрощающий технологию процесса.

Полученные по данному способу препараты могут быть использованы для профилактики холеры и колибактериозов.

Это достигается последовательным выделением сульфатом аммония из обезжиренной культуральной жидкости токсигенных и гипертоксигенных штаммов холерного вибриона соматического 0-антигена между 0,2 0,35 насыщения и анатоксина холерогена между 0,35 0,80 насыщения.

Раздельное получение полуфабрикатов анатоксина холерогена и 0-антигена позволяет, варьируя их количество, сконструировать стандартный целевой продукт (таблетки вакцины, содержащие 100000 ЕС анатоксина и по 1000 условных единиц 0-антигенов обоих сероваров).

Использование гипертоксигенных штаммов холерного вибриона (КМ-76 КМ-68 и др.) повышает выход препарата в 4 5 раз (Джапаридзе с соавт. 1991).

Упрощение технологии обеспечено раздельной стерилизацией: анатоксина через мембраны, а 0-антигена текучим паром (при 98^oС 30 мин), что позволяет использовать материал в 3 раза меньшем объеме (20 л с одного реактора). Раздельное лиофильное высушивание ускоряется во времени также из-за меньших объемов материала. Конструирование таблеток облегчается путем добавления точного количества каждого антигена к наполнителю таблетки.

Возможность осуществления изобретения показана ниже на материале, положенном в основу при составлении производственного регламента на вакцину оральную бивалентную холерную химическую таблетированную.

В качестве продуцентов используют ряд токсигенных и гипертоксигенных штаммов холерного вибриона (569В, 1802, КМ-76, КМ-68 и др.).

Пример. Холерный вибрион выращивают в условиях глубинного культивирования в реакторе в 250 л бульона из ферментативного перевара казеина или мяса рН 8,0 ± 0,2, 0,2 аминного азота 0,1 пептона, 0,5 NaCl, 0,05 Na₂HPO₄, а для гипертоксигенных штаммов 0,002 канамицина ex tempore, с аэрацией и автоматической подкормкой глюкозой (общий расход 40-ного раствора за цикл 6 ± 2 л) и аммиаком (общий расход 10%-ного раствора 0,7 ± 0,1 л). В первые четыре часа роста температуру поддерживают 37^oC, а затем в течение 5 7 ч снижают до 34 35^oC для сохранения в культуральной жидкости термолабильного холерогена. В начале стационарной фазы роста (10 11 ч выращивания), когда концентрация микробных тел, достигнув 70 100 млрд. в 1 мл, остается постоянной 2 3 ч, выращивание прекращают добавлением 0,6 формалина.

На фиг. 1 и 2 приведены наиболее типичные материалы по культурированию штаммов: физико-химические показатели процесса, которые были общим для штаммов (фиг. 1) и динамика накопления антигенов в культуральной жидкости гипертоксигенных штаммов (фиг. 2).

Закономерности роста у штаммов были сходными, log-фаза составляла в среднем 4 5 ч, через 10 11 ч наступал стационарный период роста. Основные иммуногены появились в культуральной жидкости в начале log-фазы роста (5 6 ч), количество их увеличивалось к концу выращивания. Получаемая культуральная жидкость токсигенных штаммов (569В, 1802 и др.) содержала в 1 мл холерогена в среднем 100 ед. по Датта-хаббу и 5 · 10⁵ кожных доз Крейга, а у гипертоксичных штаммов (КМ-76, КМ-68) холерогена было в 8 10 раз больше. Схематичный 0-антиген содержался в количестве 0,3 и 0,9 мг соответственно.

Убитые формалином микробные тела через 12 ч отделяют в центрифуге СГО-100 при 15000 об/мин, а надосадочную жидкость выдерживают 25 30 дней при концентрации формалина 0,2, рН 6,7, температуре 10 12^oC для образования устойчивого анатоксина и снижения токсичности 0-антигена. После этого приступают к выделению, очистке и концентрации иммуногенов.

В специальных исследованиях по хроматографическому разделению было показано, что по молекулярной массе компоненты культуральной жидкости разделяют на две группы (фиг. 3). 0-антигеносодержащие фракции выходят первым пиком (мол. м. 1 · 10⁶), основное же количество белков культуральной жидкости имеет мол. м. менее 100000. Аналогичным было поведение компонентов при электрофорезе в ПААГ. Используя эти особенности состава культуральной жидкости, проведено поэтапное осаждение из нее антигеноз холерного вибриона.

В реактор-осадитель на первом этапе добавляют сульфат аммония до 0,37 насыщения (281 ± 7,6 г соли на 1 л), перемешивают, оставляют на 18 20 ч при 18 22^oC и центрифугируют на СГО-1000 при 8000 об/мин. Полученный на роторе осадок "0-антигенсодержащая фракция" используют в дальнейшем для получения 0-антигена.

На втором этапе из центрифугата выделяют фракцию, содержащую термолабильные белки, условно названную "холероген-анатоксин", путем последующего осаждения до 0,80 насыщения (327 ± 38 г соли на 1 л исходного раствора). После сепарирования осадок диализуют, разводят дистиллированной водой до 10 мг белка в 1 мл (в среднем 20 л) и проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры "Владипор" МФА-А N2 и N3 и МФАС-ОС-3,2,1. Полученную жидкую фракцию "холероген-анатоксин" лиофильно высушивают при температуре не выше 20^oC и используют для конструирования таблеток вакцины.

Выделение 0-антигена из 0-антигеносодержащей фракции, полученной на первом этапе, проводят после диализа осадка (аппаратным способом через мембраны "Воацефан") против воды, добавляя к диализу сульфат аммония до 0,25 насыщения (190 г соли на 1 л). Образовавшийся осадок балластной фракции отбрасывают и вновь добавляют сульфат аммония до 0,50 насыщения (190 г соли на 1 л первоначального объема). После центрифугирования на сепараторе АСГ-3М со скоростью 100 мл/мин осадок диализуют против воды. Раствор 0-антигена разводят в 2 раза дистиллированной водой (в среднем до объема 4 5 л), разливают в стерильные емкости по 250 мл и проводят стерилизацию текучим паром при 98^oC в течение 30 мин или добавлением мертиолята в концентрации 1 (10 тыс. 20 тыс). В дальнейшем жидкий препарат лиофильно высушивают и используют для конструирования таблетированной вакцины.

В полученных фракциях определяют содержание антигенов в 1 мг и конструируют таблетку. Для этого к определенному количеству антигенов (обычно рассчитанному на 1000 таблеток) добавляют таблеточный наполнитель (сахар, крахмал, тальк, стеарат кальция) в гранулированном виде и таблетируют на таблеточной машине, устанавливая дозу 0,3 ± 0,03 г (10). Нанесение ацидорезистентного покрытия из ацетилфталилцеллюлозы производят в дрожжированном котле. Готовые таблетки контролируют на вес, влажность, растворимость оболочки, контаминацию, безвредность, антигенную активность, иммуногенную активность по величине ЕД₅₀, наличие 0-антигена в РПГА, реактогенность для добровольцев.

Характеристика таблетки первых производственных серий оральной холерной вакцины представлена в таблице.

Как видно из таблицы, таблетки вакцины, полученной из разных продуцентов, были стандартны, сходны по содержанию иммуногенов, ферментов, остаточной холерогенности, токсичности и иммуногенности. Отличия проявлялись лишь в большем выходе вакцины при использовании штаммов гиперпродуцентов.

Формула изобретения

Способ получения пероральной химической вакцины для профилактики холеры из культуральной жидкости холерного вибриона, обеззараженной с одновременной детоксикацией холерогена формалином, отличающийся тем, что используя штаммы с различной интенсивностью токсинообразования, проводят раздельное выделение о-антигена осаждением сульфатом аммония между 0,2 0,35 единицы насыщения и анатоксина холерогена между 0,35 0,80 единицы насыщения, стерилизацию термостабильного о-антигена перед сублимацией ведут текучим паром при 98^oС 30 мин или добавлением меротиолята в концентрации 1 10 20000 и конструируют из двух отдельных иммуногенов рецептуру таблетки.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4