О п и с а н и изобретения

Авторы патента:

G01N29/26 - устройства для ориентации или сканирования

G01N27/26 - путем определения электрохимических параметров; путем электролиза или электрофореза (определение коррозионной стойкости G01N 17/00; путем разделения на составные части с использованием адсорбции, абсорбции или подобных процессов или с использованием ионного обмена, например хроматографии G01N 30/00; иммуноэлектрофорез G01N 33/561; электрохимические процессы и аппараты вообще B01J; стандартные элементы H01M 6/28)

j аатентмс -тсм.яческал

6нбпмоте "s 14БД Оюз Сбвб спмх

QQцмапмстммфскмя

Рй©пуйпмк

ОП ИКАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства №вЂ”

М Кл. 6 01п 33/16

Заявлено 19.1.1972 (№ 1741193/28-13) с присоединением заявки №вЂ”

ПриоритетвЂ”

Опубликовано 22.Х.1973 Бюллетень № 44

Дата оlI i 6 1H!KQBBIIIIH опи сания 25. IV. 1974

10сударстиеииый иемктет

0иаита Мииистреи СЕР

w делам изое„ етеиий и птииытий

УДК 637.627.6. (088.8) Авторы изобретения Д. И. Погоняйло, Л. В. Богданов, Л. М. Погоняйло и И. С. Марцинкевич

3 аяв итсл ь Белорусский научно-исследовательский институт животноводства

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ЖИДКОСТЯХ

Известен способ количественного определения содержания белковых фракций в биологических жидкостях, например молоке, включающий электрофорез, окрашивание электрофореграмм, отмывку их, элюирование связавшегося с белком красителя и определение экстинкцни элюпрованного красителя.

Известньш способ .предусматривает бумажный электрофорез с последующим элюированием связаппой с протеином краски и определение экстинкцни. Однако посредством бумажного элект рофореза невозможно получить точное разделение белковых смесей на фракции.

Предлагаемый способ повышает точность и значительно ускоряет разделение белковых смесей на фракции и количественное определение содержания протеина в электрофоретически различимых фракциях.

Достигается это тем, что перед электрофорезом пробу;разделяют на две части и в одной из них осуществляют электрофорез HB крахмальном геле, а в другой определяют содержание общего белка, например, методом Кьельдаля, после электрофореза гель разрезают на фракции и находящиеся против них конт рольные участки такой же площади, лишенные белка, при этом экстинкцию кусочков геля с отдельными фракциями определяют против элюата из соответствующего участка геля, лишенного белка, элюирование проводят насыщенным раствором мочевнны, а по экстинкции определяют соотношение белковых фракций с последующим пересчсгом их процентного соде|ржания на содержание белка в каждой фракции.

Электрофореграмму окрашивают в насыщенном растворе амидового сине-черного красителя в жидкости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 5:1:5.

Для количественного определения белковых l0 фракций берут 50 г молока, в 1О мл осуществляют электрофорез, а в оставшейся части определяют содержание общего белка и казеина по

Кьельдалю. Пробу обезжиренного молока для электрофореза подвергают разделению:на вы1з вороточные белки и казеины при изоэлектрической точке казеннов. Сыворотку отфильтровывают:3 бумажном фильтре, после,его казеин промывают четыре раза водой, четыре раза этанолом, два раза ацетоном и два раза этило20 вым эфиром.

Навеску казеина в количестве 20,иг растворяют в 1 ил буферного раствора, применяемого для заварки геля.

Разделение белков молока на фракции проводят методом горизонтального электрофореза в крахмальном геле с прерывистой системой буферов.

В качестве электролитного буфера использу;от раствор, состоящий нз 11,8 г борной кислоты и 2,1 г г идрата окиси лития на 1 л электро40507

Предмет изобретения

Составитель М. Ларина

Редактор Л. Ксенофонтова

Корректор Н. Аук

Техред Л. Богданова

Заказ 999 Изд. Ко 1082 Тираж 755 1Io q mtct to

IЛ1!П11П11 Госуд??рствсиио<о ко?иитсти Советв Министров СССР ио Ic÷à?t изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушскви ииб., д. 4/5

0o t. Till?. 1< и11и в зси?1?1 и ?л?lте льет Ä ?<

К каждому литру гелевого буфера добавляют

190 мл электролитного, а затем моче<вину до 5

6,6 М. К буферу с мочевиной перед заваркой добавляют 2-меркаптоэтанол из расчета 2 мл

HB 1 л. Гель готовят из 14,5% взвеси частично гидрол изо<ванного драхм?ала.в буфере путем заварки на открытом пламени с последующим 10 удалением пузырьков воздуха под вакуумом.

В пластину геля размером 13,5><,2О)<,0,6 см

Yà кусочках фильтровальной бумаги размером 6><,7 мл вносят по три образца нативного казеина и сыворотки от каждой пробы молока. 15

После электро1фореза гель разрезают с помощью устройства, обеспечивающего получение нижней «÷èñòîé»,ïëàñòèíû с равномерной по всей площади толщиной в 3 нм. Фореграмму окрашивают в течение 15 л?ин в насыщен- 20 ном растворе амидового сине-черного красителя в жидкости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и <воды в пропорции 5:1:5. Жидкость без красителя применяют для отмывки фореграмм.

Хорошо отмытые фореграммы обсу1шивают фнльтровальной бумагой и разделяют по фракциям специально изготовленными пробойниками. На каждый образец сыворотки или казеина вырезают свой контрольный участок, свободный от белка. Таким образом, каждая фракция одной пробы представлена трижды, что значительно увеличивает точность способа.

Кусочки геля помещают во флаконы объе- 05 мом 10 л л и наливают 5 мл насыщенного раствора мочевины. Элюирование продолжается

72 час, из них 48 «ас при комнатной температуре и 24 час в термостате <при 37 С.

Экстинкцию элюата определяют на спектро- 40 фотомел1ре II

t 625 нм проти<в контролявЂ” элюата гелевой пластинки с фоном. Сумму показателей экстинкции по каждой пробе принимают за 1 00%, показатель экстинкции каждой

4 фракции пересчитывают в процентах по отношению и сумме. Количество белка в сыворотке вычисляют по разности между общим белком и белком <казеина.

Зная количество белка в цельном казеине и сыворотке, а также процентное соотношение содержания белка в сывороточных и казеиновых фракциях, рассчитывают содержание протеина во всех электрофоретически различимых фракциях молока.

1. Способ количественного определения содер>кания белковых фракций в биологических жидкостях, на при<мер молоке, включающий электрофорез, окрашиванне эле?<трофорегра<мм, отмывку их, элюирование связавшегося с белком красителя и определение экстинкции элюированного красителя, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности разделения белковых смесей на фракции и повышения точности определения, перед электроф<хрезом пробу <разделяют .на две части и в о дной из них осуществляют электрофорез на крахмальном геле, а в другой определяют сойер>кание общего белка, например, методом Кьельдаля, после эле1етрофореза гель разрезают на фракции и находящиеся против них такой же площади контрольные участки, лишенные белка, при этом экстинкцию кусочков геля с отдельными фракциями оп<ределяют 1проти<в элюата из соответствующего контрольного участка геля, лишенного белка, элюирование проводят насыщенным раствором мочевины, а по экстин<кции спределяют соотношение белковых фракций с последующим пересчетом их процентного содер>кания па содержание белка в каждой фракции.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что электрофореграмму окрашивают в насыщенном растворе амидового сине-черного красителя в жид<кости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 5:1:5.