Способ получения -сульфоната в-цепи инсулина человека

 

,ii) 487066

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Саоэ. Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное и авт. свид-ву (22) Заявлено 17.07.72 (21) 1812855/23-4 (51) М. Кл. С 07с 103 52 с присоединением =-,":явки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 05.10.75. Бюллетень ¹ 37

Дата опубликования описания 31.05.76

Государственный комитет

Совета Министров СССР

Ао делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) (72) Авторы изобретеш я М. И. Титов, 3. A. Ардемасова, )К. Д. Беспалова и Л. И. Леонтьева (71) Заявитель Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. А. А. Жданова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ S — S -СУЛЪФОНАТА

В-ЦЕПИ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к усовершенствованию способа получения инсулина человека, применяемого в медицине.

Известен способ получения S — S -сульфоната

В-цепи инсулина человека путем конденсации низших пептидов, например защищенного пептида Bi g, с защищенным пептидом В> ц известным методом, удаления защитных групп окислительным сульфитолизом и выделения целевого продукта известным способом.

К недостаткам известного способа относятся сложность процесса и довольно низкий выход целевого продукта.

С целью упрощения технологии процесса и повышения выхода целевого продукта предлагается защищенный пептид последовательности 1 — 8 конденсировать с защищенным пептидом последовательности 9 — 14 методом смешанных ангидридов, полученный защищенный пептид последовательности 1 — 14 превращать в гидразид обработкой трифторуксусной кислотой; защищенный пептид последовательности 15 — 20 конденсировать с защищенным пептидом последовательности 21 — 30 методом активированных эфиров, с полученного защищенного пептида последовательности 15 — 30 удалять N-конечную защитную группу ацидолизом; гидразид пептида последовательности

1 — 14 конденсировать азидным методом с защищенным пептидом последовательности 15—

30 и с полученного защищенного пептпда последовательности 1 — 30 удалять защитные группы действием бромистого водорода в трифторуксусной кислоте.

Пример 1. Бис- (карбобензокси-фенилаланил-валил-аспарагинил-глутаминпл - гпстидиллейцил) -цистинил-бис- (глицпл-О-трет - бутиловый эфир-серил-гпстидпл-лейцил-валил)- трет-бутиловый эфир-глутамил-аланил-трет10 бутилоксикарбонил-гидразид.

0,120 г карбобепзокси-О-трет-бутиловьш эфир-серпл-гистидил - лейцил-валил-у - третбутиловый эфир-глутамил-аланпл-трет-бутилоксикарбонпл-гидразида суспендируют в 5мл метанола и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение двух дней. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре водой и метанолом, фильтрат упаривают досуха, растворяют остаток в 2 мл гексаметапола, до20 бавляют и раствору 0,120 г бис-(карбобензокси-фснилалани 1-валил-аснар".ãë:ï,l - глутаминил-гистидил-лейцил) -цистшгил-бпс-глпцина

0,031 г дициклогексплкарбодиимида, выдерr1DII331OT $82 JH5i при 0 С и дв«jHSI IIplk ком25 на1 ной температуре. Отфи lb гровывают дицпклогексилмочсвину, разбавляют фильтрат эфиром, отфильтровывают вьи.авший осадок, промывают его на фильтре смесью метанол— эфир, сушат и получают 0,125 г продукта, со30 держащего 1,2 (1) цистеина, 1,8 (2) гистиди487066

65 на, 0,7 (1) аспарагиновой кислоты, 0,4 (1) серина, 1,0 (1) глиципа, 1,5 (2) глутаминовой кислоты, 1,7 (2) валина, 0,6 (1) фенилаланиа, 1,8 (2) лейцина, 0,7 (1) аланипа.

Здесь н далее в скооках указано теоретичеСКОС Ко.rrt×CC.r БО аМИНОКИСЛОТ.

П р и и е р 2. Etre-(о-нитрофенилсульфениллейцил-тирозил-лейцил-валил) -цистинил - бис(глицил-у-трет-бутиловый эфир-глутамил-аргинил-глицил - фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил - в-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонин) .

K раствору 1,0 г бис-(о-нитрофенилсульфенил-лейцил - тирозил-лейцил-валил) -цистинилбпс-глицина и 0,2 г и-нитрофенола в 15 мл

ДМФЛ при — 10 С добавляют 0,3 г дициклогексилкарбодиимида, оставляют на ночь при

0 С, отфилыровывают дициклогсксилмочевину, разбавляют фильтрат водой, экстрагируют этилацетатом, сушат и упаривают экстракт досуха. После кристаллизации остатка из смеси изопропиловый спирт — гексан получают

0,6 г (50 /о) продукта, т. пл. 270 С (разл.);

I1 ) 6 22 (с 1, ДМФЛ)

Найдено о/о. С 54,39; Н 6,73

С86H!1otU16О124$4.

Вычислено, %. С 54,39; Н 6,00.

0,9 г карбобензокси-11-трет-бутиловый эфирглутамил-аргинил - глицил-фенилаланил - фенилаланил-тирозил - треонил - пролил-в-третбутилоксикарбонил-лизил-треонина растворяют в 10 мл метанола, добавляют 5,36 мл

0,10н. серной кислоты и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение трех дней.

Катализатор отфильтровывают, упаривают

1рильтрат досуха, растворяют остаток в

50 /, -ном метаноле и обрабатывают ионообменной смолой Лмберлит ИРА-410 (OH — -форма). Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре 50% -ным метанолом, упаривают фильграт досуха, сушат остаток в вакууме над пятиокисью фосфора и растворяют в 4 мл

ДМФЛ. К полученному раствору добавляют

0,4 г продукта, полученного выше, выдерживают один день при комнатной температуре, разбавляют эфиром, отделяют осадок центрифугированием, кристаллизуют из метанола и получают 0,7 г (77%) продукта, т. пл, 174—

178 С; (а)ОО = — 26 (с=1, ДМФА) .

Найдено, % . .С 56,89; Н 7,33.

СлФзюоМ4 06 $4 ° 2Н О.

Вычислено, %. .С 56,92; Н 6,85.

Лминокпслотный состав: цистеин 1,1 (1), лизин 0,9 (1), аргинин 0,6 (1), глицин 1,7 (2), глутаминовая кислота 1,0 (1), тирозин 1,0 (2), лейцин 2,7 (2), фенилаланин и валин 3,5 (3), треонин 1,9 (2) .

Пример 3. $,S -Дисульфонат В-цепи.

50 мг продукта, полученного в примере 1, растворяют в 10 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 час при комнатной температуре, упаривают досуха, разбавляют остаток водой и снова упаривают досуха. Эту операцию повторяют еще три раза. Остаток после

1О

З5

45 ,-0

55 упар trrarrrtst растворяют в 10 мл ДМФЛ, доî6rãëÿtoò 0,07 мл 2,00 н. раствора НС1 в тетрагидрофуране, при — 20 С добавляют 0,1 мл раствора, содержащего 1,9 мг нитрита натр1гя, ыдерж IBBIOT 30 мин при — 20 С, охлаждают 1ллуче,шый азид до — 10 С и нейтрализуют триэтп;:амином.

62 мг продукта, полученного в примере 2, растворяют з 5 мл метанола, охлаждают до

0 С и добав.1яют 0,1 мл уксусной кислоты и

0,1 мл 0,3и. раствора НС1 в метаноле. Через

10 мин смесь упаривают досуха, растворяют остаток в воде и обрабатывают ионообменной смолой Лмбсрлит ИРА-410 (ОН вЂ” -форма), Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре водой, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в минимальном количестве ДМФА и при — 40 С добавляют к раствору, содержащему азид. Полученную смесь выдерживают три дня при — 5 С и два дня при комнатной температуре, упаривают досуха, ос;аток растворяют в 30 мл трифторуксусной кислоты и в течение 2 час пропускают через раствор сухой бромистый водород. Раствор упаривают досуха при комнатной температуре, сушат остаток в вакууме над твердой щелочь1о и пятиокисью фосфора, растворяют в

10 мл дпоксана и 6 мл 0,2н. трис-буфера (pI 8,1) . К полученному раствору добавляют

110 мг сульфита натрия и 60 мг тетратионата натрия, выдерживают 12 час при комнатной температуре и 2 час при 37 С, диализуют

6 час против нескольких смен дистиллированной воды, р" ñòâîð после диализа упаривают до небольшого объема и лиофилизуют, Получают 12 мг (13%) продукта, (ug = — 95+5 (с=-0,1, 0,5 н. уксусная кислота).

Лминокислотный анализ: лизин 1,15 (1), гнстидин 1,92 (2), аргинин 0,92 (1), аспарагиновая кислота 1,05 (1), треонин 1,94 (2), серии 0,97 (1), глутаминовая кислота 3,18 (3), пролин 1,10 (1), глицин 3,0 (3), алании 1,0 (1), цистеин 1,59 (2), валин 2,85 (3), лейцин 3,77 (4), тирозин 1,85 (2), фенилаланин 2,72 (3).

Электрофорез проводят на бумаге при напряжении 1000 — 1200 в и экспозиции 50 — 60 мин в 2,6-ной уксусной кислоте, проявляя бензидинсм и хлором, и в буферном растворе, содержащем 4М мочевину, муравьиную кислоту и уксусную кислоту (13: 3: 2), проявляя реактивом Паули. Во всех случаях продукт был индивидуальным, его подвижность совпадала с подвижностью бис-сульфоната В-цепи инсулина быка, выделенного из природного инсулина и использованного в качестве свидетеля.

Предмет изобретения

Способ получения S — S -сульфоната В-цепи инсулина человека конденсацией низших пептидов известным методом с последующим удалением защитных групп окислительным сульфитолизом и выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса

Составитель Л. Фонина

Техред T. Миронова

Корректo;) А. Дзесова! редактор T. Шарганова

Заказ 1027/9 Изд. № 56 Тираж 529 Подписное

Цг1ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений tt QTI pl>tTHtt! 13035, Москва, Ж-35, Раушская иао.. д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 и повышения выхода целевого продукта, защищенный пептид последовательности 1 — 8 конденсируют с защищенным пептидом последовательности 9 — 14 методом смешанных ангидридов и полученный защищенный пептид последовательности 1 — 14 превращают в гидразнд обработкой трифторуксусной кислотой; защищенный пептид последовательности 15—

20 конденсируют с защищенным пептидом последовательности 21 — 30 методом активироБ;11111 ых 3(()IIpOII ll с по IV tICIII101 0 за Щищснно(о пецтида последовательности 15 — 30 удаляют

N-конечную защитную группу ацидолизом; гидразид пептида последовательности 1 — 14

5 конденсируют азидным методом с защищенным пептндом последовательности 15 — 30 и с полученного защищенного пептида последовательности 1 — 30 удаляют защитные группы действием бромистого водорода в трифторук10 сусной кислоте.