Способ очистки ферментных препаратов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (») 551 339 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.09.75 (21) 2178099/04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет

I (43) Опубликовано 25.03.77. Бюллетень № 11 (51) M. Кл.о С 07 6.7/02// т!А61К37/48

Государстеенный комитет

Совета Министроа СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) (45) Дата опубликования описании 23.06.77 (72) Авторы изобретения В. М. Степанов, С. В. Беляев, Л. Ф. Матяш, Т, Л. Воюшина и Т. А. Соловьева

Всесоюзный научно-исследовательский инсппут генетики и селекции промышленных микроорганизмов (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к способу получения, высокоочищенных ферментных препаратов, которые могут найти применение в пищевой, медицинской и микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике. Эти ферментные препараты могут быть использованы, в частности, в таким процессах, как производство сыров, соков, вин или медицинских сывороток.

В литературе описано большое количество способов очистки ферментов (1) . Наиболее распространенным и удобным методом очистки ферментов является метод жидкостной хроматографии, заключающийся в адсорбции растворенных ферментов на носителе, отделения от носителя с применением солевых буферных растворов, с последующим обессоливанием раствора очищенного фермента, например, диализом. При этом в общем случае прочность связывания фермента с носителем определяется многими физико — химическими особенностями фермента, характером и расположением заряженных групп, степенью диссоциации при данных условиях, размером молекул и т.д. и степень очистки фермента зависит не только от условий разделения, но и от типа применяемого носителя — адсорбента.

Наиболее широко при таком способе очистки ферментов используются ионнообменные носители на основе целлюлозы, такие, как диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-Ц) и карбоксиметилцеллюлоза (КМ вЂ” Ц). Известны и другие ионнообменные материалы такие, как, например, ионнообменные смолы типа Абмерлит, Дауэкс, применяемые для очистки некоторых белков, однако, менее эффективные для большинства белков, чем производные целлю1р лозы.

Известен, в частности, способ очистки ферментов с применением в качестве носителя ДЭАЭ-Ц

2 (2). Однако этот способ обладает рядом сущест15 венных недостатков. Во-первых, материал носителя часто оказывается нестоек к отдельным компонентам исходного ферментного препарата и загрязняет очищенный фермент продуктами распада. Во-вторых, материал носителя легко подвергается дейст

20 вию микроорганизмов. В-третьих, все известные материалы на основе целлюлозы при работе в колоночном варианте обладают высоким гидродинамическим сопротивлением. Это обстоятельствс приводит к длительным операциям с pdcTBoðàìè

25 ферментов, снижая выход активного фермента, 551339

Предлагается способ очистки ферментных нре паратов путем ионообменной хроматографии на широкопористых адсорбентах на основе двуокиси кремния, например силохромах, которые для избирательного действия на ферменты и сопутствую 5 щие им примеси и белки модифицируют различными реагентами, содержащими ионогенные группы.

В общ"м случае способ осуществляют следующим образом.

Раствор неочищенного фермента вводят в кон 10 такт с адсорбентом на основе двуокиси кремния которому .;приданы необходимые свойства путем обработки его химическими реагентами. Выбор реагентов дпя модификации адсорбентов на основе двуокиси кремния проводят, исходя из известных 111 или предполагаемых физико-химических свойств биологического объекта, подлежащего выделению, и сопутствующих ему приме ей (изоэлектрическая точка, полярность и т.п.) .

Установлено, что модифицированный снлохром, щ содержащий анионогенную аминогруппу (аминосилохром), способен избирательно связывать кислые протеиназы такие, как пепсины и химозины, причем оптимальное связывание указанных ферментов проявляется при рН исходной среде выше изоточки фермента, например дпя пепсина при рН 2,4 — 6,0, дпя химозина при 4,6-6,0.

Модифицированный силохром, имеющий катионогенную сульфогруппу алкил/арил/ сульфокислоты, обладают избирательным дествием на ней- 30 гральные и щелевые протеиназы, оптимум действия при рН 6,0-8,0.

Таким образом, используя избирательность взаимодействия модифицированного силохрома на билологически активные вещества, можно произво- 85 дить разделение ферментов и их отделение от примесей.

В качестве элюентов используют растворы солей, кислот и т.д., в воде или органических растворителях. 40

Установлено, что оптимальные условия дпя элюции кислых протеиназ создаются при применении буферов с рН ниже изоэлектрической точки ферментов — дпя пепсина с рН 1,5-2,4 и для химозина с рН 2,0-4,5, 45

Используя буферы с различным рН в пределах

1,5-6,0, можно произвести разделение различных видов кислых протеиназ. Данный способ позволяет не только очищать ферменты от сопутствующих им примесей, но и в ряде случаев позволяет разделять 50 родственные ферменты, например пепсины и химозины, субтилиэины.

Пепсины и химозины относятся к кислым протеиназам, поэтому прн обработке их смеси аминосилохромом адсорбируются оба фермента. Дпя их 55 разделения применяют последовательно элюзию

5. мм (pH 2,4) и 50мм (рН 1,5) растворами соляной кислоты. Первая фракция элюата (рН 2,4-4,5) содержит фермент химознн; вторая фракция элюата (рН 1,5-2,4) — фермент пепсин. 60

Дпя разделения таких протеинаэ, как трипсин и субтилизины, их сорбируют на сульфосипохроме при рН 6,0-8,0, а элюцию ведут, используя буферы: дпя трипсина с рН 3,0-5,0; суьтилизина — с рН

8,0-12.

Таким образом, создавая оптимальные условия дпя адсорбирования и элюции того или иного фермента, можно обеспечить высокий выход продукта высокой степени чистоты при сохранении его высокой активности.

Очищенный фермент можно использовать в виде раствора или высушенным. Высушивают фермент лиофильно. Дпя сохранения активности ферt мента при лиофильной сушке раствор очищенного фермента обрабатывают анионитом дпя удаления из раствора кислоты.

На фиг. 1 и 2 приведены хроматограммы двух процессов — очистки коммерческого препарата свиного пепснна на аминосилохроме и очистки и разделения на аминосилохроме пепсина и химозина из коммерческого препарата, полученного из желудков телят (сплошная линия — оптическая плотность злюата с хроматографической колонки с аминосилохромом, измеренная детектируюшим устройст вом при длине волны света 280 нм; пунктирная линия — изменение рН элюата; точки — измерение удельной активности, измеренной по скорости гидролиза гемоглобина в фракциях элюата; стрелки— последовательность смены элюентов: 1 — промывка колонки с адсорбированными на ней ферментами исходным буфером, 2 и 3 — начало пропускания через колонку 5 мм и 50 мм соответственно растворов кислот. Максимумы оптической плотности на фиг. 1, обозначенные буквами, соответствуют: А— примесям, не адсорбированным колонкой и смытым исходным буфером; Б — примесным пигментам и белкам, десорбируемым:. с колонки буфером 2 и В - ферменту пепсину, десорбируемому с колонки буфером 3 и обладающему высокой протеолитической активностью (Д) . Максимумы оптической плотности на фиг.2 соответствуют:А — примесным белкам и пигментам, не адсорбированным на колонке и смытым исходным буфером; Б ферменту химозину, десорбируемому с колонки буфером 2, и  — ферменту пепсину, десорбируемому с колонки буфером 3. Максимумы плотности Г соответствуют примесям, которые десорбируются с колонки при ее регенерации 1 М раствором соляной кислоты. Участки хроматограммы на фиг.2, выделенные вертикальной штриховкой, показывают удельную активность фракций элюата, определенную по створаживанию молока, и соответствуют максимумам оптической плотности. Наибольшая удельная активность (E) соответствует максимуму (Б), т.е. фракции, содержащей фермент химозин. В указанных условиях достигается высокая очистка и четкое разделение ферментов. обпацающих соответствующими им высокими активностями (Д и Е) .

В примере 1 приведен способ очистки свиного пепсмна на немопифицированном силохроме марки

551339

19

И

И

С-80. Из сравнения удеяьиой лливиости федмен тов, очищенных по способам, цриведеииым в примерах 1 и 2 (примере 2 для очистки свиного пепсина использован * аминосилохрсет — модифицированный сило хром, содержащий иовЗгенные аминогруппы), видно, что модификация приводит к избирательному действию носителя на очищае мый фермент (сл. фиг. 1).

Пример 1. Очистка пепсина на силохроме.

Буферный раствор с рН 3,0 — 6,0 (целесообразно

3,5-5,5) содержащий неочищенный свиной пенсии с удельной активностью около 19 единиц активности ,(оптическую единицу (е.а./о.е.) пропускают через хроматографическую колонку, заполненную силохромом марки С вЂ” 80. Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером 5мм и 50 мм растворами соляной кислоты (НС1) . Собирают фракцию элюата с колонки с рН 1,5 — 2i,4. Удельная активность пепсина в указанной фракции составляет 25 — 30 е,а./о.е.

Пример 2. Очистка пепсина на аминосилохроме. Хроматограмма процесса очистки представлена на фиг. 1.

Буферный раствор с рН 3,0 — 6,0 (целесообразно

5,4), содержащий неочищенный свиной пенсии с удельной активностью около 15 — 30 е.а./о.е. пропус1 кают через хроматографическую колонку, заполненную аминосилохромом (модифицированным силохромом, имеющим анионогенную аминогруппу) .

Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером (1) 5 мМ (2) и 50 мМ (3) растворами НС1. Собирают фракцию элюата с колонки с рН

1,5-2,4. Удельная активность йепсииа в указанной фракции, определенная по методу Ансона, составляет 60 — 75 е.а,/o,å. Перед лиофилизацией раствор фермента обрабатывают ионитом марки АВ

17 — 8/АВ 16 ГС, Дауэкс 1 х 16 и т.п./ в 0H — или

СН> СОΠ— форме, увеличивая рН раствора до

2,5-6,0, целесообразно 3,5-5,5. Выход фермента по активности после лиофилизации составляет около

70-80%, Пример 3. Очистка и разделение пепсина и химо зина.

Хроматограмма процесса представлена на фиг.2.

Буферный раствор с рН 4,5 — 6,0 (целесообразно

5,4), содержащий ферментный препарат, полученный иэ желудков телят, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную аминосилохромом. Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером (!) 5 мМ (2) и 50 мМ (3) растворами НС! . Собирают фракции элюата с рН 2,4- 4,5 и 1,5 - 2,ч. йервая фракция содержит фермент химозин (молокоствораживающий фермент) с удельной активностью, определяемой по створаживанию молока, равной 30000 ед. активности на миллиграмм фермента (е.а./мг). Вторая фракция содержит лепсин желудка телят и обладает претсо1 литической активностью, определяемой по расщеп,лению гемоглобина (метод Лисона), равной 20-30 а.е./о.е. Профиль кривой злюзни с колонки приведен на фиг 3. Перед лиофилизацией указанные фракции обрабатывают иопитами марки АВ 17

-8/AB 16 ГС, Дауэкс1 х 16 и т.п./ в OH- или

СНэСОО-форме. Выход химозина по активности составляет около 80%, Пример 4. Очистка субтилизина на аминосило хроме.

Буферный раствор, рН 6,0 - 11,0, целесообразно 6,0- 8,0, содержащий фермент субтилизин,пропускают через колонку, заполненную аминосилохромом. Элюат с колонки содержит свободный от сопутствующих пигментов и других примесей субI тилизин с активностью в 8-15 раз выше исходной, определяемой по расщеплению синтетического субстрата и-нитроанилида карбобензоксиглицил - глицил - л - лейцина, Пример 5. Очистка и разделение субтилизинов на сульфосилохроме.

Буферный раствор с рН 6,0- 11,0, целесообразно 6,0- 8,0, содержащий субтилизин, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную сульфосилохромом — модифицированным силохромом, имеющим катионогенную сульфогруппу алкин 1арил/сульфокислоты. Затем адсорбенг промы-. вают последовательно исходным буфером с рН

6,0-8,0 и буферами с рН 8,1 - 9,0 и 10-11. Собирают фракции элюата с колонки с рН в пределах

8,0 - 11,0, содержащие практически чистый субтилизин, свободный от примесных белков и пигментов.

Пример 6. Очистка трипсина на сульфосилох роме.

Буферный раствор с рН 6,0-8,0, содержащий три сии, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную сульфосилохромом. Затем адсорбейт промывают последовательно исходным буфером и 1 мМ раствором IICl с рН 3,0 Собирают фракции элюата с колонки с рН 3,0 - 5,0, содержащие высокоактивный трипсин, по данным элсктрофореэа, свободнь:й ог сопутствующих примессй и белков. Примеси элюируются с колонки при последующей ее промывке 10 мМ pBGTBcpGM щелочи или

1,0 М раствором НС1.

Пример 7, Очистка иммуноглобулинов.

Буферный раствор, рН 6,0-9,0 целесообразно, 0,05 М фосфатный буфер с рН 7,0-8,0, содержащий препарат пчацента рного человеческого иммуноглобулина, пропускают через колонку, заполненную аминосилохромом. Элюат с колонки при промывке ее исходным буфером содержит практически чистый плацентарный иммуноглобулин. Примеси элюируются с колонки при последующей ее промывке 10 мМ раствором щелочи или 1,0 М раствором, соляной кислоты. рормула изобретения

1. Способ очистки фсрментных препаратов пу тем адсорбции растворенных ферментов на нос гге- :

551339

2,0

1,0

1000 1500

Обьем злата, мЛ.

Фиг. 1 ле с последующим отделением от носителя с приме. .нением солевых буферов, отличающийся тем, что с целью получения ферментов высокой степени чистоты при сохранении их высокой активности, обеспечения высокого выхода продукта и сокращения времени очистки, в качестве носителя используют вещества на основе двуокиси кремния, например с. DIoxpoMbr, модифицированные реагентами и содержащие ионогенные группы для избирательного связывания ферментов. и сопутствующих им примесей.

2. Способ по п. 1, î i ли чающийся тем, что для избирательного связывания ферментов и сопутствующих им примесей применяют однократное или последовательное адсорбирование на силохромах, модифицированных реагентами и содержащих различные или одинаковые ионогенные группы, а отделение от носителя производят путем применения одного или нескольких буферов.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что для избирательного связывания таких ферментов, как кислые протеиназы, например пепсины и химозины, из веществ на основе двуокиси кремния, используют вещества, содержащие анионогенные группы, например амнносилохромы.

4. Способ по п.ч. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й. с я тем, что для избирательного связывания таких ферментов, как щелочные и нейтральные протеиназы, например субтилизины, нз веществ на основе двуокиси кремния используют вещества, содержащие катионогенные группы, например сульфосилохромы.

5. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что, кислые протеиназы, такие, как различные пепсины, адсорбируют на носителе при рН исходного раствора 2,4-6,0, а отделяют ог носителя, применяя буферы c рН 1,5-2,4. б 6, Способно пи. 1-3, отличающийся тем, что кислые протеиназы, такие,как различные химозины, адсорбируют при рН исходного раствора

4,5-6,0, а отделяют от носителя, применяя буферы с рН 2,0-4.5.

7. Способно пп. 1,2,3,5,6, о тличающ ич ся тем, что для: очистки и разделения кислых протеиназ, например, таких, как пепсины и химозины, их адсорбируют на носителе и затем отделяют от

;носителя последовательно путем применения нес,кольких буферов с рН 1,5-4,5.

8Способпопп. 1и4,отличающий ся тем, что нейтральные и щелочные протеиназы, такие, как трипсин и субтилизин, адсорбируют на сульфосилохроме нри рН исходного раствора 6,0-8,0, а отделяют он носителя, применяя буферы. для субтилизина с рН 8,0-12,0 а для трипсина с рН 3,0-5,0.

9. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что дпя избирательного связывания пигментов и бел сов, сопутствующих таким протеиназам, как субтилизины, последние адсорбируют, применяя вещества на основе двуокиси кремния такие, как например, аминосилохром.

\.

Источники информации, принятые во внимание при зкспертизе:

1. Степанов В. Н., Грейль Т. И. Биохимия" том 28, стр. 540, 1963г. (прототип) .

2. Циперович А. с:. "Ферменты", Техника, Киев, 1971 r.

551339

Составитель А. Богаров

Техред М. Левицкая

Корректор С. Болдижар

Редактор Н. Джагаретти

Тираж 553 Подписное

Ц11ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобрсгеннй и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 83/14

Филиал ППП " Патент ". г. Ужгород. ул. Проектная, 4 л ч Фц ец